5xFAD转基因小鼠与阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白特征的异同

孟 霞 李 梦 王晶晶 张 静, 2, 3 陈柏安, 2, 3* 卢 静, 2, 3

(1.首都医科大学实验动物部，北京 100069；2.首都医科大学基础医学院实验动物学学系，北京 100069；3.首都医科大学基础医学院神经再生修复研究北京市重点实验室，北京 100069)

脑内β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)聚集形成的斑块是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)主要的神经病变之一，其与AD的发生、发展密切相关，是研究AD发病机制及药物治疗的重要靶标[1]。研究[2]显示许多已知的AD风险因素会增加Aβ聚集及斑块形成，研究Aβ斑块在AD的研究中占重要的位置。研究[3]显示AD患者脑内的Aβ斑块表现为致密型和弥散型。典型的致密型Aβ斑块具有一个致密的核心，在核心周围呈晕状，又称为日冕状，在日冕状外周呈不规则的弥漫状斑块。而不典型的致密型Aβ斑块呈致密状，缺乏日冕状结构。弥散型Aβ斑块与致密型Aβ斑块相比表现为分散或松散状，像絮状、星状、条带状分布，其大小、形状、密度、位置不一，规律性不强[4]，研究[5-6]显示脑内弥漫型Aβ斑块比致密型Aβ斑块出现更早且分布更广。此外，在AD患者脑内血管中也观察到Aβ沉积，形成淀粉样脑血管病变(cerebral amyloid angiopathy，CAA)[7]。在AD患者脑内通常可见Aβ斑块和CAA，是AD重要的神经病变特征[8-9]。

脑内Aβ生成增加或Aβ降解减少会导致Aβ聚集形成斑块，淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因或早老素(presenilin,PSEN)基因突变是目前已知能导致脑内形成Aβ斑块的明确原因。Oakley等[10]和Jawhar等[11]陆续构建了5xFAD(B6SJL)转基因小鼠和5xFAD(C57BL6)转基因小鼠，其携带人APP基因和PSEN1基因中5个AD相关的突变，包括APP中的突变K670N/M671L，I716V和V717I，以及PSEN1中的突变M146L和L286V。5xFAD转基因小鼠早至2月龄时即在脑内(包括海马、皮质和丘脑等)出现Aβ斑块[12]，脑内Aβ斑块会诱发小胶质细胞和星形胶质细胞增生。此外，5xFAD转基因鼠约在3月龄时可见CAA[13]。因5xFAD携带了AD致病基因突变，且其脑内发生Aβ斑块和CAA很早，该小鼠广泛应用于Aβ斑块相关的致病机制及AD治疗的研究。

虽然5xFAD广泛应用于AD相关的致病机制及治疗研究，但其脑内的Aβ斑块与AD患者脑内的Aβ斑块在形态、数量、类型等特征方面的异同至今未见详细报道。本研究利用免疫荧光染色通过单克隆抗体(4G8)检测了5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中的Aβ斑块，利用CaseViewer和GraphPad Prism 8软件对其脑内Aβ斑块进行了定性定量分析，比较了5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中Aβ斑块在形态、数量、类型等特征的异同。

1 材料与方法

1.1 实验标本及动物

(1)AD患者大脑组织样本：AD患者大脑组织由北京师范大学崔孟超教授惠赠，包括AD1(95岁，女性)、AD2(85岁，男性)，AD3(64岁，女性)大脑组织包括颞叶皮质和海马。

(2)实验动物：5xFAD小鼠(Tg6799，MMRRC品系号：34840-JAX)来自Jackson实验室，5xFAD小鼠与C57BL/6小鼠繁殖后代，根据Jackson实验室的方法取小鼠尾尖DNA通过PCR鉴定基因型。本研究使用12月龄5xFAD小鼠3只，包括5xFAD1(雄性)、5xFAD2(雌性)，5xFAD3(雌性)，在首都医科大学实验动物部屏障环境饲养，实验动物许可证号：SYXK(京)2015-0012，经首都医科大学实验动物伦理委员会批准(批号：AEEI-2015-020)。

1.2 小鼠心脏灌注固定取大脑

小鼠腹腔注射1%(质量分数)戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg)，经深度麻醉后，使用4%(质量分数)多聚甲醛进行心脏灌注，直至小鼠四肢僵硬，取大脑组织，4%(质量分数)多聚甲醛浸泡固定48 h。

1.3 大脑组织免疫荧光染色

固定后的大脑组织脱水包埋，切片(厚度4 μm)待用，石蜡切片置于65 ℃烘箱中烘片2h，脱蜡、水化后，PBS冲洗3次，5 min/次；EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10 min低火至沸；自然冷却后PBS洗3次，5 min/次；3%(体积分数)过氧化氢溶液中室温孵育10 min；PBS洗涤3次；5%(质量分数)的BSA封闭20 min；Aβ特异性单克隆抗体4G8(1∶200，800701，Biolegend公司)进行免疫荧光染色。

1.4 图像分析及数据统计

使用CaseViewer软件采集图像，GraphPad Prism 8软件进行图像统计分析，在不同放大倍数下观察脑内Aβ斑块分布、形态、直径、数量等特征。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 5xFAD转基因小鼠及AD患者大脑中Aβ斑块类型检测结果

5xFAD转基因小鼠和AD患者大脑(海马和皮质)中均可见明显的Aβ斑块，其中致密型Aβ斑块，结构致密，形似球状；弥散型Aβ斑块，结构疏松，形似絮状(图1)。

2.2 5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑CAA检测结果

5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑血管壁上均可见明显紫红色的Aβ沉积形成的CAA，形似环状。5xFAD转基因小鼠大脑中CAA的形态与AD患者大脑中的CAA高度相似(图2)。

图2 5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中均可见明显的CAA

2.3 5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中Aβ斑块检测结果

AD患者大脑中有大小不一的Aβ斑块，按照其直径可分为5类，其直径分别为<15 μm、[15，30)μm、[30，45)μm、[45，60)μm、以及60 μm。与AD患者相似，在5xFAD转基因小鼠大脑中也可见上述5类直径范围的Aβ斑块(图3)。

图3 5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中均有大小不一的Aβ斑块

2.4 5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中相同面积内不同直径Aβ斑块数量比较

对5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑相同面积(62 464 μm2)内不同直径的Aβ斑块数量进行了定量分析。5xFAD转基因小鼠脑内直径为[45，60)μm和≥60 μm的Aβ斑块数量与AD患者相比，差异无统计学意义(P=0.167、P=0.159)；而直径为[15,30)μm和[30,45)μm的Aβ斑块数量高于AD患者，直径<15 μm的Aβ斑块数量则低于AD患者，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图4 5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中相同面积内不同直径Aβ斑块数量的异同

2.5 5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中Aβ斑块类型及形态比较

在AD患者脑内主要可见弥散型Aβ斑块、不典型的致密型Aβ斑块以及典型的日冕状致密型Aβ斑块(图5A)，但是在5xFAD转基因小鼠脑内主要可见弥散型Aβ斑块、不典型的致密型Aβ斑块(图5B)，未见典型的日冕状致密型Aβ斑块(图5C)。

3 讨论

5xFAD转基因小鼠携带了人APP基因和PSEN1基因中5个AD相关的突变，导致脑内Aβ生成增加，随年龄增长在其脑内可见Aβ斑块[10-11]。本研究选用老年5xFAD小鼠(12月龄)与年龄相当的老年AD患者(>60岁)大脑组织，利用免疫荧光染色通过单克隆抗体(4G8)检测了二者脑内的Aβ斑块。老年5xFAD小鼠脑内可见弥散型Aβ斑块和致密型Aβ斑块，这与AD患者相同(图1)。但是在AD患者脑内可见典型的日冕状致密型Aβ斑块，而在5xFAD转基因小鼠脑内未见该类Aβ斑块。典型的日冕状致密型Aβ斑块与非典型的致密型Aβ斑块及弥散型Aβ斑块在形态上明显不同(图5)，研究[14]显示随着年龄增加和病程延长，典型的日冕状致密型Aβ斑块中的日冕状结构发生崩解，随后转变为不典型的致密型Aβ斑块，然而AD患者脑内典型的日冕状致密型Aβ斑块是偶然形成还是受某种机制调控而形成尚不清楚。为何5xFAD小鼠脑内未形成典型的日冕状致密型Aβ斑块，可能与小鼠脑内环境与人差异大有关，具体原因尚待进一步研究。此外，应注意5xFAD转基因小鼠脑内Aβ斑块是由于APP和PS1基因突变导致Aβ生成增多所致，这与家族性AD患者相似，但是散发性AD患者脑内Aβ斑块的形成与年龄、APOE基因分型、环境等多种因素有关。总之，5xFAD转基因小鼠与家族性AD患者脑内Aβ斑块形成的原因相似，而与散发性AD患者脑内Aβ斑块形成的原因差异大，但是5xFAD转基因小鼠脑内弥散型Aβ斑块和致密型Aβ斑块在形态上与AD患者高度相似，因此5xFAD小鼠是用于研究弥散型和致密型Aβ斑块形成及致病机制的理想动物模型。

图5 5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑组织中Aβ斑块的种类不完全相同

AD患者脑内可见Aβ在血管中沉积形成的CAA，Aβ在血管中沉积会损伤血管的中层和外膜，促使基底膜增厚，导致血管腔狭窄，容易发生出血，破坏血-脑脊液屏障，损伤认知功能[15-18]。在本研究中，5xFAD转基因小鼠脑内可见Aβ在血管中沉积形成CAA，其形态与AD患者脑内的CAA高度相似，因此5xFAD小鼠也是用于研究CAA形成及致病机制的理想动物模型。

研究[19-21]显示AD患者脑内Aβ斑块随时间推移逐步形成，即先形成小的弥漫型Aβ斑块，之后随着Aβ不断聚集，逐渐形成致密型Aβ斑块，体积也逐渐增大，甚至出现超大斑块。但是，随着年龄增长和病程进展，大的致密型Aβ斑块随之崩解，又出现以大量小的弥散型Aβ斑块为主的特征[22]，这提示了Aβ斑块的形成可能存在动态规律。本研究结果显示在AD患者脑内有大小不一的Aβ斑块，包括直径<15 μm、[15，30)μm、[30，45)μm、[45，60)μm以及≥60 μm这5类Aβ斑块(图3)，其中以直径<15 μm的Aβ斑块为主(图4)。在5xFAD转基因小鼠脑内也可见上述5类Aβ斑块，其也以直径<15 μm的Aβ斑块为主，与AD患者相似，但是5xFAD转基因小鼠脑内直径<15 μm的Aβ斑块数量/62 464 μm2少于AD患者，直径为[15，30)μm和[30，45)μm的Aβ斑块数量/62 464 μm2则多于AD患者，而直径为[45，60)μm和≥60 μm的Aβ斑块数量/62 464 μm2与AD患者比较，差异无统计学意义(图4)。本研究结果提示5xFAD转基因小鼠脑内直径>45 μm的Aβ斑块数量/62 464 μm2与AD患者相似，而小于45 μm的Aβ斑块数量/62 464 μm2与AD患者差异有统计学意义，因此在利用5xFAD转基因小鼠开展Aβ斑块相关研究时应考虑这些与AD患者异同的因素。

致谢：感谢北京师范大学崔孟超教授惠赠该研究中的AD患者脑组织。