小胶质细胞组蛋白去乙酰化酶3在低压低氧诱导的氧化应激中的作用

李 珺 李硕硕 彭志鑫 廖亚金 程金波* 袁增强*

(1.首都医科大学脑重大疾病研究院，北京 100069；2.军事医学研究院军事认知与脑科学研究所，北京 100850；3.南华大学衡阳医学院，湖南衡阳 421001；4.中央民族大学生命与环境科学学院转化神经科学中心，北京 100081)

我国幅员辽阔，高原地区国土面积位居世界第一。在医学上，高原是指能引起机体生物学效应的海拔高达2 500米以上的广泛地区[1]。高原地区温度低，温差大，湿度低，阳光辐射强烈，而低压低氧是最为显著的特点[2]。宏观上，中枢神经系统器官——脑，对于低氧十分敏感，气压降低导致供氧稳态的失衡，引起脑血管重构导致血管源性脑水肿[3]及机体认知障碍[4-5]。微观上，细胞缺氧导致线粒体功能异常，产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)引发氧化应激反应[6-7]。在氧化应激状态下ROS的升高可以激活下游信号通路，导致小胶质细胞激活，小胶质细胞分泌的促炎因子，进一步加剧了神经炎性反应[8]。近年来有研究[9]显示，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases 3，HDAC3)在巨噬细胞中，通过非乙酰化作用引起急、慢性炎症，巨噬细胞中HDAC3的缺失，可以减少线粒体膜的破坏，使ROS的产生减少。本课题组前期研究工作显示，急性缺血缺氧导致小胶质细胞活化，神经炎症水平升高。敲除小胶质细胞HDAC3可以缓解缺血缺氧导致的脑损伤和神经炎症[10]。目前，高原低压低氧环境导致脑损伤产生的分子机制还不清楚。本研究利用高原低氧仓与低氧细胞培养箱模拟高原环境处理小鼠和小胶质细胞，利用蛋白质免疫印迹和实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)等技术，探究高原缺氧是否会导致神经炎症，以及HDAC3是否在这一过程中发挥作用，为高原性脑病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

SPF级C57BL/6J小鼠(购于斯贝福生物技术有限公司)；实验室饲育的HDAC3flox/flox和HDAC3flox/flox；CX3CR1CreER小鼠[实验动物使用许可证号：syxk(军)2019-0004][10]。袁增强课题组实验室冻存的BV2细胞系和稳定敲低HDAC3的BV2细胞系。

将HDAC3flox/flox小鼠与CX3CR1CreER小鼠杂交，使其产生后代HDAC3flox/flox; CX3CR1CreER小鼠(cKO小鼠)，利用他莫昔芬(tamoxifen)灌胃诱导小胶质细胞特异性敲除HDAC3。

1.2 主要试剂和仪器

ROS检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，货号：S0033S)，DMEM培养基(美国Gibco公司，货号：C11885500BT)，RNA反转录试剂盒(全式金生物技术公司，货号：O10306)，诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗体(美国BD Biosciences公司，货号：610332，1∶1 000配制)，缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factors-1α, HIF-1α)抗体(英国Abcam公司，货号：ab179483，1∶1 000配制)，超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase，SOD)抗体(碧云天生物技术有限公司，货号：S0088，1∶1 000配制)，HDAC3抗体(美国Cell Signaling Technology公司，货号：85057S，1∶1 000配制)，HDAC3抑制剂RGFP966(美国Selleck Chemicals公司，货号：S7229)。

1.3 高原缺氧小鼠模型建立

将14只2月龄健康C57BL/6J雄鼠使用简单随机分组法分成2组，常压常氧组(常氧组)、低压低氧组(低氧组)各7只。常氧组在正常氧环境下喂养，低氧组置于模拟 6 000米海拔环境的低压氧舱，每3天降舱后，加食、喂水。将14只2月龄HDAC3flox/flox雄性小鼠使用简单随机分组法分成常氧组、低氧组各7只，常氧组在正常氧环境下喂养，低氧组置于模拟 6 000米海拔环境的低压氧舱，每3天降舱后，加食、喂水。连续饲养7 d后断颈处死小鼠，取小鼠脑组织进行相关检测。

1.4 缺氧细胞模型建立

BV2细胞以及稳定敲低HDAC3的BV2细胞分别分为5组，以60%的密度铺于12孔的细胞培养板，12 h更换培养基后，一组常氧培养(常氧组)，另四组(低氧组)放入低氧培养箱，通入0.1%(体积分数)氧气，5%(体积分数)二氧化碳，分别低氧处理2、4、6、8 h，然后收集样品进行相关检测。

1.5 RGFP966处理细胞

将RGFP966粉末溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成6 mmol/L母液，处理细胞终浓度为6 μmol/L。加入RGFP966后进行低氧处理2、4、6、8 h，然后收集细胞进行检测。

1.6 ROS检测

按照1∶1 000比例用无血清培养液稀释DCFH-DA母液至终浓度为10 μmol/L，准备ROS染色试剂。然后将培养的细胞中培养液弃去，加入适当体积稀释好的DCFH-DA进行染色。于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min后，用无血清细胞培养液洗涤多余染料，之后收集细胞用流式细胞仪检测荧光值，使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，实时检测刺激前后荧光的强弱。

1.7 mRNA的检测

加入500 μL/孔Trizol 提取细胞总RNA和脑海马组织总RNA，用微量紫外分光光度计检测RNA的浓度及纯度。然后取1 μg总RNA用 RNA反转录试剂盒按照说明书方法反转录成cDNA。最后用real-time PCR法检测HIF-1α、HDAC1/2/3、iNOS、CD206、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、SOD的mRNA水平。所用PCR引物如表1所示。

表1 PCR引物

1.8 Western blotting法测定组织和细胞相关蛋白表达

Western blotting法测定各组HIF-1α、HDAC3、iNOS、SOD蛋白表达，β-actin 作为内参标记蛋白。SDS-PAGE 电泳分离蛋白，对应一抗标记，辣根过氧化物酶标记二抗结合后ECL显色液显影，X线曝光，扫描各条带灰度值，Image J分析条带灰度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 低压低氧暴露对小鼠脑内氧化应激相关因子的影响

通过real-time PCR检测低氧组小鼠和常氧组小鼠海马区的iNOS、SOD、HIF-1α的mRNA水平。结果显示，两组间低氧相关因子HIF-1α及炎症因子CD206、ARG1水平差异无统计学意义(P>0.05)。但低氧组iNOS和SOD的浓度明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，低氧组HDAC3浓度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而HDAC1以及HDAC2组间差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1。

图1 低压低氧暴露后小鼠脑部海马区相关因子mRNA表达水平检测

2.2 低氧处理对BV2小胶质氧化应激相关因子的影响

利用低氧细胞培养箱模拟高原低氧环境对BV2细胞进行低氧处理[1%(体积分数)O2]2、4、6、8 h后，通过real-time PCR检测HIF-1α、iNOS、HDAC3、SOD的mRNA水平。结果显示，低氧处理组和常氧组低氧相关因子HIF-1α水平差异无统计学意义(P>0.05)。但低氧处理组iNOS、SOD和HDAC3的水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白质免疫印迹检测以及灰度统计结果显示低氧处理组HIF-1α、iNOS和HDAC3的蛋白表达量明显高于常氧组。通过流式细胞仪检测ROS探针荧光强度，结果显示低氧组ROS的浓度明显高于常氧组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

图2 低氧处理增加小胶质细胞的氧化应激水平

2.3 抑制HDAC3减轻低氧导致的氧化应激水平

RGFP966处理显著抑制了低氧导致的iNOS、SOD的mRNA表达水平的升高，差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白质免疫印迹结果显示RGFP966处理显著抑制了低氧导致的iNOS蛋白表达水平的升高。从mRNA和蛋白水平确定HDAC3稳定敲低细胞株具有较好的敲低效果。低氧处理后，结果显示低氧处理4 h，HIF-1α的mRNA水平没有显著改变，但敲低HDAC3的细胞中HIF-1α蛋白水平较未敲低组增加，差异有统计学意义。并且敲低HDAC3显著降低了低氧暴露后iNOS和SOD的mRNA升高和iNOS蛋白增加。与此一致，敲低HDAC3显著降低了低氧诱导的ROS升高。详见图3。

2.4 特异性敲除小胶质细胞HDAC3可减轻低压低氧导致的氧化应激反应

首先检测HDAC3的敲除效率，通过分选脑内小胶质细胞进行Western boltting检测，发现HDAC3的表达水平在HDAC3flox/flox；CX3CR1CreER小鼠中显著下降(图4A)。随后，将cKO小鼠与野生型小鼠置于低压低氧舱中，模拟6 000米海拔高度连续处理7 d(图4B)。结果显示，低压低氧暴露后iNOS和SOD的mRNA水平在cKO小鼠中显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)(图4C、4D)。

图4 特异性敲除小胶质细胞HDAC3可减轻低压低氧所引起的氧化应激反应

3 讨论

研究[4]表明，根据暴露时间的长短，高原低氧环境会对机体造成可逆或不可逆的影响。但是高原病的病理生理过程尚未明确，也未发现一些高原病的特异性生物学标志物。本研究以BV2小胶质细胞和HDAC3条件性敲除小鼠为研究对象，探究低压低氧对脑内氧化应激的影响及小胶质细胞HDAC3在其中的作用。

机体的各项生命活动离不开氧气，机体的组织、细胞以各种方式感受外界氧气浓度的变化，外界氧浓度的改变分为两种，一种是局部改变例如肿瘤或局部损伤[11-12]，另一种是全身性改变，例如当机体处于高原低压低氧环境[13]。常氧状态下HIFs上的α亚基的脯氨酸残基被脯氨酰羟化酶羟化而快速降解。缺氧条件下，脯氨酰羟化酶会被抑制，HIFs蛋白表达显著增多[14-16]。有研究[14]显示暴露在严重缺氧环境下的大鼠脑内HIF-1α的表达高于常氧组的大鼠，缺氧又可以引起氧化应激反应，但进行缺氧预适应后不引起氧化应激反应，因此缺氧诱导的HIF-1α的表达独立于脑内氧化应激状态的存在。在本实验中，对缺氧细胞模型的检测发现HIFs蛋白表达量显著增多，因此将低氧处理后细胞HIF-1α蛋白表达量升高作为细胞低氧模型构建成功的标志。氧化应激在神经系统损伤中扮演着十分重要的角色，研究[17]表明在各种神经系统退行性疾病中，神经系统的细胞中自由基代谢平衡严重失调，对于自由基的防御能力明显下降，过量的自由基可使生物膜磷脂双分子层中的不饱和脂肪酸过氧化，而形成脂质过氧化物，从而使组织细胞的结构和功能发生障碍。

实验中笔者发现低压低氧暴露引起小鼠脑内氧化应激相关因子升高，这表明低压低氧可以引起神经系统氧化应激反应。在小胶质细胞中特异性地敲除HDAC3后，低压低氧暴露引起小鼠脑内氧化应激相关因子下调，这表明小胶质细胞中敲除HDAC3可以缓解低压低氧所导致的氧化应激反应。提示HDAC3参与了低压低氧导致的氧化应激反应。HDAC3属于HDACs，是大脑中表达最广泛的HDACs[18-19]。抑制HDAC3减少相关蛋白去乙酰化作用，可以抑制相关炎症信号通路的激活，减轻缺血再灌注引起的脑损伤，有助于减轻神经退行性疾病中的运动表型缺陷和转录失调[20]。本实验中，敲除小胶质细胞中HDAC3后可减轻低压低氧导致的氧化应激反应，可能与HDAC3的去乙酰化作用导致转录受到抑制有关，HDAC3的特异性抑制剂可能成为高原脑损伤治疗的有效药物，还有待深入研究。

氧化应激状态下会伴随着抗氧化能力的降低，例如SOD的下调[21]。但是也有研究[22-23]显示神经炎症以及内分泌疾病所导致的氧化应激反应中伴随着SOD的上调。本实验中低压低氧暴露后，ROS水平升高，这直接证明了氧化应激反应的发生。而BV2小胶质细胞以及小鼠脑内SOD显著升高，造成这个差异的原因，一方面可能来自于氧化应激反应持续时间的不同；另一方面还可能是由于超氧化物成分的相对比例不同。文献[24]显示，小胶质细胞氧化应激水平的增加促进细胞核易位和细胞信号通路的激活促进iNOS和促炎细胞因子的表达，从而进一步延长大脑氧化应激和炎症循环。但是本实验中没有发现低压低氧暴露后炎症因子的显著上调，导致这个现象的原因可能在于小鼠相对于人类对于高原环境的抵抗能力更强，此外还可能由于小鼠低压低氧处理的时间短、采样过程中标本复氧等原因，从而无法引起强烈的神经炎症的发生。

本研究揭示了暴露于低压低氧环境中将导致脑组织及小胶质细胞氧化应激水平升高，抑制HDAC3则可以缓解该现象，进一步丰富了HDAC3在缺氧相关疾病中的作用研究。在此基础上，本课题组将继续研究干预HDAC3是否可改善低压低氧导致的认知功能降低，从而为相关疾病的防治提供药物靶点和理论依据。