溃疡性结肠炎中B细胞对巨噬细胞趋化作用的初步研究

张兴华 邢 洁 孙 灿 张 希 王拥军

(首都医科大学附属北京友谊医院消化内科 国家消化系统疾病临床医学研究中心消化分中心，北京 100050)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)系由多种免疫细胞参与的肠道自身免疫性疾病。结肠炎相关结直肠癌(colitis-associated cancer，CAC)是结直肠癌的一种亚型，与溃疡性结肠炎密切相关。流行病学统计结果[1]证明，超过20%的溃疡性结肠炎患者在未来30年内会发展成为CAC，治疗难度和病死率均高于散发性结肠癌。临床及基础研究[2-4]表明，溃疡结肠炎肠道炎症环境至少由巨噬细胞、髓样来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、树突状细胞、T/B淋巴细胞、肥大细胞、自然杀伤 T 细胞(natural killer T cells, NKT)以及自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)等免疫细胞参与。各类型免疫细胞与上皮细胞以及免疫细胞之间相互调控及反馈机制复杂多样，形成了庞大的免疫调控网络，因而目前尚有诸多问题处于探索阶段。本研究将利用经典氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(azoxy-methane/dextran sodium sulpate,AOM/DSS)小鼠CAC模型作为研究对象，对B细胞与巨噬细胞的趋化作用机制进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 CAC小鼠模型诱导及分组

选择18～20 g左右的雌性C57/BL6小鼠[购自中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号：SCXK(京)2018-0002]。腹腔注射AOM(购自美国Sigma公司)(剂量为 12.5 mg/kg)和口服3个过程的2.5%(质量分数)DSS(购自美国Sigma公司)。依照该疾病病程，分为正常对照组、第一程AOM/DSS组(AD1组)、第二程AOM/DSS组(AD2组)和第三程AOM/DSS组(AD3组)，每组实验动物6只。

1.2 严重联合免疫缺陷小鼠(server combined immune-deficiency mice,SCID)小鼠免疫重建实验

选取T细胞及B细胞双缺陷的SCID/Beige小鼠[购自中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号：SCXK(京)2018-0002]。作为研究对象，通过流式细胞分选法获取正常C57/BL6野生型小鼠脾脏中的B细胞，于口服DSS第0天通过尾静脉回输给 SCID 小鼠。SCID小鼠的CAC诱导、各阶段标本的采集与野生型C57一致。

1.3 外周血及结肠组织中细胞比例的测定

外周血中免疫细胞比例的测定：采集不同病程的小鼠眼血，每组3～5只，通过Ficoll密度梯度离心法分别获取小鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)。封闭非特异位点，加入荧光抗体，同时制备空白细胞管、同型对照管、实验组抗体管，于24 h内完成流式细胞仪上机检测，所得数据用FlowJo软件分析。

结肠组织中免疫细胞比例的测定：采集不同病程的小鼠结直肠组织，每组3～5只，通过胶原酶 A和DNase Ⅰ解离结肠组织，筛网过滤去除组织杂质，重悬获取单细胞悬浮液。封闭非特异位点，加入荧光抗体，同时制备空白细胞管、同型对照管、实验组抗体管，于24 h内完成流式细胞仪上机检测，所得数据用FlowJo软件分析。

1.4 组织免疫荧光共定位

石蜡包埋的白片先脱蜡和水化，热修复法修复抗原，3%(体积分数)H2O2去除内源性过氧化物酶活性。封闭非特异位点，滴加一抗并孵育，清洗多余一抗，滴加荧光二抗并孵育。DAPI染色细胞核并孵育，去离子水冲洗多余染色液。使用 Invitrogen 抗淬灭荧光封片剂进行封片，-20 ℃保存，激光共聚焦显微镜下观察。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 B细胞和巨噬细胞在野生型小鼠模型结肠组织中的变化趋势

随着CAC的疾病进展，B细胞(CD19+B220+)在野生型小鼠结肠组织内浸润比例逐渐增加，正常对照组、AD1组、AD2组和AD3组的比例分别为2.55%±0.14%、3.55%±0.25%、4.16%±0.21%和5.05%±0.17%，组间比较差异有统计学意义(F=17.093 9，P=0.000)。巨噬细胞(CD11b+Gr-1-F4/80+)在野生型小鼠结肠组织内浸润比例也呈逐渐增加趋势，正常对照组、AD1组、AD2组和AD3组的比例分别为0.03%±0.01%、1.15%±0.11%、1.51%±0.14%和1.85%±0.13%，组间比较差异有统计学意义(F=318.698，P=0.000)。详见图1。

图1 在CAC疾病进展各阶段，B细胞及巨噬细胞在结肠组织中的浸润比例情况

2.2 免疫重建后巨噬细胞在SCID小鼠模型结肠组织中变化趋势

分别予SCID小鼠免疫重建野生型B细胞后诱导CAC模型，通过流式细胞法分析小鼠结直肠组织中巨噬细胞的浸润情况。对照组(SCID-PBS)及回输B细胞组(SCID-B)的巨噬细胞浸润比例分别为0.038%±0.014%和0.072%±0.015%(n=6，t=3.974，P=0.003)。详见图2。

图2 免疫重建B细胞后巨噬细胞在SCID小鼠模型结肠组织中变化趋势

2.3 单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP1/CCL2)的变化趋势分析及与B细胞的共定位分析

利用流式细胞分选法获取正常CD57/BL6小鼠及SCID病小鼠结直肠组织中的B细胞，通过real-time PCR法分析显示，SCID小鼠B细胞的CCL2转录水平高于正常小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，通过 CD20 荧光抗体标记溃疡性结肠炎小鼠结直肠组织中的B细胞，发现 CD20 与 CCL2 在结肠组织中有共定位现象。详见图3。

图3 B细胞与CCL2变化趋势图

3 讨论

多项研究[5-7]表明，溃疡性结肠炎患者发病时间越长，其结肠癌的患病率越高，10年发生结肠癌的概率为1.6%，20年结肠癌概率为8.3%，30年结肠癌概率为18.4%。因此，欧洲[8]和美国的指南[9]均建议病史大于 10 年的溃疡性结肠炎患者每年需行针对结肠癌的内镜筛查。

巨噬细胞是一群异质细胞，根据其功能和表型主要可分为 M1 型及 M2 型。目前的观点[10]认为，肿瘤相关巨噬细胞主要为M2型巨噬细胞，在肿瘤细胞及肿瘤微环境的诱导下，起源于骨髓的单核细胞可分化形成具有独特表型的巨噬细胞。总结目前研究结果，巨噬细胞与肿瘤的关系主要体现为以下几方面：①参与正常上皮细胞的恶性转化：巨噬细胞可表达多种刺激肿瘤细胞增殖和存活的细胞因子，如上皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)等，尤其是在结直肠癌和乳腺癌的形成过程中发挥重要作用[5-6]。②介导细胞免疫抑制：M2型巨噬细胞在肿瘤微环境下可导致细胞免疫低下，尤其是抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性[7]。③介导肿瘤细胞的侵袭转移：巨噬细胞与肿瘤细胞共培养，可提高肿瘤细胞的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及基质金属蛋白酶依赖的侵袭特性。在肿瘤细胞产生的集落刺激因子的诱导下，巨噬细胞合成EGF，诱导促进肿瘤细胞迁移及侵袭相关基因的表达水平上调，增强肿瘤细胞在胶原基质中的定向运动及侵袭活性。综合以上三点，巨噬细胞的浸润被认为是肿瘤发生发展的标志性事件[11-13]。

经典免疫学理论认为，分布于肠道黏膜的 B 细胞主要为分泌IgM的B1细胞，其主要功能是参与机体的非特异性免疫反应。B 细胞与溃疡性结肠炎的关系研究相对较少，目前的研究[14]大多显示结肠组织中B细胞的免疫球蛋白表达谱可能影响小鼠肠道共生菌群，并由此调控肠道炎症水平。本课题组研究显示，随着溃疡性结肠炎的进展，B细胞在小鼠结肠的浸润比例逐渐升高，提示 B细胞可能参与了溃疡性结肠炎的病程发展，该结论也在其他基础及临床研究[15]中得到了验证，但其机制尚未明确。

本研究显示，以相同的溃疡性结肠炎造模方法用于SCID小鼠，小鼠结肠组织内未检测到巨噬细胞浸润，而回输野生型小鼠B 细胞后再次造模，结肠组织内巨噬细胞浸润水平与野生型小鼠模型接近，该现象提示，在溃疡性结肠炎病程中，B 细胞发挥了募集巨噬细胞到结直肠组织浸润的功能。

巨噬细胞来源于骨髓 CD34+的祖细胞，祖细胞通过分化形成前单核细胞释放到外周血中进一步分化成炎性单核细胞。游走于外周血的炎性单核细胞穿越血管壁到达结肠组织，在此过程中的迁移主要依靠趋化因子及其受体的作用。CCL2也被称为单核细胞趋化蛋白-1，主要来源于内皮细胞、成纤维细胞、星状胶质细胞、平滑肌、上皮细胞、单核细胞及部分肿瘤细胞等，主要对表达CCR2、CCR4 及CCR10的细胞介导趋化作用，而其中最主要的靶点为CCR2。在多种炎症模型中[16]，高水平炎症因子会使得炎症组织局部CCL2表达上调，更多的巨噬细胞被募集至炎症组织加重局部炎症水平，其中尤以TNF-α作用最强。在小鼠结肠癌模型中，野生型小鼠结肠癌组织内有高水平的 TNF-α、CCL2 及巨噬细胞浸润，而当敲除小鼠 TNF-α 表达后，结肠组织局部 CCL2 表达水平及巨噬细胞浸润同时明显降低[17]。基于以上研究，TNF-α 的靶向抗体英夫利昔单抗已被作为激素抵抗型溃疡性结肠炎的一线治疗方案写入临床指南[9]。其可通过与单核细胞表面的相应受体，即CCR2结合，促进骨髓以及外周血中的单核细胞募集到结肠组织。CCR2 基因敲除的结肠炎小鼠不再会发生结肠癌，同时用 CCL2 封闭抗体治疗野生型结肠炎小鼠，小鼠恶性转化的趋势也明显得到了控制，其机制可能与巨噬细胞的浸润降低相关[18]。2016 年的一项临床研究[19]表明，结肠癌患者结肠组织内 CCL2 的表达水平与患者的不良预后呈正相关。本研究利用免疫荧光抗体检测溃疡性结肠炎小鼠的CCL2来源，发现CCL2与B细胞特异表面抗原CD20存在共定位现象，进一步通过流式分选法获取溃疡性结肠炎小鼠和正常小鼠结肠组织B细胞，发现溃疡性结肠炎小鼠B细胞的CCL2 转录水平明显高于正常小鼠。综合以上研究结果，溃疡性结肠炎结肠组织中的B细胞是CCL2的主要来源之一，并可通过趋化作用募集巨噬细胞至结直肠组织内参与溃疡性结肠炎相关结肠癌的发生发展。