铁皮石斛中石斛多糖、石斛碱、石斛酚的联合提取

徐艳飞,夏 谦,李康银,李小丽,谷 红

(1.玉溪农业职业技术学院,云南 玉溪 653106；2.云南和瑾科技有限公司,云南 昆明 675400)

铁皮石斛(Dendrobium officinale KimuraetMigo)是兰科石斛属，为兰科第二大属，包括1500多种植物[1]。我国的石斛种类有74种，2个变种，大多分布在云南、贵州、广东、广西、浙江等地[2]。石斛是一种多年生草本植物，采收2～3年生为好，11月至翌年3月釆收,药用部位为新鲜品或干燥的根茎。铁皮石斛化学成分及药理活性是目前石斛领域研究的热点与重点[3]。近年来，从具有药理活性的40多种石斛中分离出将近100种活性化合物，包括：石斛多糖、石斛碱、石斛酚、氨基酸、黄铜、萜类、甾体、微量元素等[4-6]。大量药理活性研究表明，铁皮石斛具有免疫调节、抗肿瘤、抗突变、降血压、降血脂、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗辐射、抗溃疡、抗衰老等功效[7]。除药用外，石斛作为保健食品已有几千年的历史。因此这些活性成分在提高免疫力、抗衰老、抗疲劳等方面进行中成药制剂成品与保健品的开发极具前景[8]。铁皮石斛中的活性成分石斛多糖、生物碱、联苄酚等均为重要的功能化合物，这些活性物质的提取纯化已成为近年来的一个研究热点，但以往的研究多为单一活性成分分离提取及药理活性研究，对他们的联合提取和对石斛中石斛酚的提取及含量测定方面的研究较少，造成铁皮石斛原材料的极大浪费。因此，对铁皮石斛中多糖、石斛碱、石斛酚的联合提取对于铁皮石斛这种珍贵中药材的综合利用具有重要的现实意义[9]。本研究利用冷浸-超声、乙醇回流提取、醇沉返溶等方法，对铁皮石斛中石斛多糖、石斛碱、石斛酚进行了联合提取，并进行含量、纯度测定，具有流程简单、工艺可靠、纯度高、生产成本低等优势。

1 材料与设备

1.1 材料和试剂

铁皮石斛(购自云南省昆明市呈贡区云南端端生物科技有限公司)，鉴定为3年生最佳采收期采收的石斛鲜条(2 kg)，经 110 ℃ 杀青 30 min，60 ℃ 烘干至恒重，粉碎，过三号筛(0.355 mm)；无水葡萄糖对照品(用前 105 ℃ 烘 2 h)、石斛碱对照品、石斛酚对照品(购于中国食品药品检定研究所)；苯酚试剂(分析纯，200 mL 苯酚，加入 0.2 g 铝片和 0.1 g 碳酸氢钠蒸馏，收集182馏分。称取 17 g，加水 150 mL 混匀，溶解即得，置棕色瓶中，放入冰箱备用)；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、其他试剂(分析纯)、屈臣氏蒸馏水、实验室自制去离子水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱分析仪(岛津LC-10AT/SPD10A)；色谱工作站(LabSolutions LCsolution)，紫外可见分光光度计(UV-2550)；气相色谱分析仪(岛津GC2010 Pro)；超声波清洗器(KQ5200E)；旋转蒸发仪(RE-5286A)；电子天平(BT2202S，北京赛多利斯仪器有限公司)；离心机(LD5-2A)；冻干机(SJIA-10N-60D)；超微滤膜(津腾50×0.22 μm)；家用多功能料理机(CX-301，中山市九阳小家电有限公司)。超纯水系统(上海叶拓YTUP-30)，电热恒温干燥箱(IKA HB10)、电热套、酸度计(PHS-25)

2 方法与结果

2.1 石斛多糖、石斛碱、石斛酚的联合提取

取 110 ℃ 杀青 30 min，60 ℃ 烘干至恒重，粉碎，过三号筛(0.355 mm)的铁皮石斛粉 20 g，加入 80 ℃ 超纯水浸泡 8 h 以上，超声 20 min，离心过滤得滤液(A部分)和滤渣(B部分)两部分。或用新鲜铁皮石斛加10倍无水乙醇打浆，加 60 ℃ 水搅拌提取 1 h，过滤得滤液和滤渣两部分。

2.1.1 石斛多糖的提取与精制

取A部分滤液，加入无水乙醇至无沉淀产生，离心过滤。所得滤液可蒸馏回收乙醇。所得沉淀加5倍的水返溶，将所得溶液在旋转蒸发仪上蒸发浓缩至体积为原来的1/10，加入乙醇达80%质量分数，在冰箱中静置醇沉，过夜。离心过滤，弃上层清液。将沉淀用乙醚、无水乙醇依次洗涤，过滤，所得滤液经冻干机预冻 10 h，再进行真空冻干即得石斛多糖精品 4.2631 g。流程如图1所示。

图1 石斛多糖的提取纯化

2.1.2 石斛碱、石斛酚的提取与精制

取B部分滤渣，用无水乙醇回流提取 1 h。所得滤液旋蒸回收乙醇，离心过滤；所得固体于恒温干燥箱中 70 ℃ 烘干，即得石斛碱和石斛酚。向该固体中加入10%稀盐酸，4000 r/min 离心 20 min,过滤得固体为石斛碱，纯度为12%；液体为石斛酚，经 70 ℃ 烘干的纯度为27%石斛酚。流程如图2所示。

图2 石斛碱、石斛酚的提取纯化

2.2 石斛多糖含量测定

石斛多糖测定采用苯酚-硫酸法[10]。

2.2.1 标准曲线的绘制

1)多糖对照品溶液的制备。精密称取无水葡萄糖对照品 10 mg，加水溶解并定容至 100 mL，即得 100 μg·mL-1的对照品溶液。

2)标准曲线的制备。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置 10 mL 具塞试管中；分别往里补水至 1 mL，得质量浓度分别为10、20、40、60、80、100 μg/mL 的标准系列溶液。分别精密加入5%苯酚溶液 1 mL，震荡摇匀，再精密加入浓硫酸 5 mL，置沸水浴中加热 20 min，取出置冷水浴中冷却至室温；以 1 mL 水，同法操作，作为空白对照。按照紫外-可见分光光度法，在 490 nm 波长处测吸光度，得回归方程为y=0.008x-0.0067，相关系数R2=0.9998。

图3 无水葡萄糖标准曲线

2.2.2 石斛多糖样品的测定

精密称取2.1.1项下制得的石斛多糖精品 20 mg，加水溶解定容至 100 mL，取 1.0 mL 置于具塞试管中，按“2.2.1标准曲线的绘制”项方法进行测定。

2.3 石斛碱的测定

石斛碱的测定采用酸性染料比色法。

2.3.1 石斛碱标准曲线的绘制

精密称取石斛碱对照品 1 mg，用氯仿溶解并定容至 100 mL，得 10 μg/mL 石斛碱对照品溶液。精密量取对照品溶液1、2、3、4、5 mL，用氯仿稀释至 10 mL；加入 5 mL pH4.5的HAc-NaAc缓冲液和 2 mL 0.04%溴甲酚绿溶液，剧烈振摇 3 min，室温静置 30 min;将氯仿层用经氯仿浸泡干燥后的药棉滤过。取续滤液 5 mL，加 1 mL 0.01 mol·L-1氢氧化钠无水乙醇溶液。以氯仿 10 mL，同法操作，作为空白对照。按照紫外-可见风光光度法，在 620 nm 处测吸光度。得回归方程为：y=0.1667x-0.0075，R2=0.9994。

图4 石斛碱对照品标准曲线

2.3.2 石斛碱样品的测定

精密称取本实验2.1.2项下制得的石斛碱样品 50 mg，置于 100 mL 容量瓶中，用氯仿溶解并定容至 100 mL。其余同2.3.1“石斛碱标准曲线的绘制”项下操作方法，测定石斛碱的含量。

2.4 石斛酚的测定

超高效液相色谱-电化学检测法(UPLC-EDC)测定所得产品中的石斛酚[11]。

2.4.1 石斛酚标准曲线的绘制

精密称取 20 mg 石斛酚对照品，加入甲醇溶解并定容至 100 mL，得 20 mg/L 石斛酚标准溶液，于-20 ℃ 储存备用。取石斛酚标准溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mL，分别加入甲醇稀释至 100 mL，得质量浓度为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00和 10.00 μg/mL的标准系列溶液。按照以下色谱条件测定：色谱柱C18柱ODS柱(4.6 mm×150 mm，粒径 5 μm)；柱温 30 ℃；流动相为 20 mmol/L 乙酸铵溶液(pH3.6)-乙腈[60%∶40%(体积比)]；流速 1 mL/min；进样量 10 μL；ECD检测电压 520 mV，检测波长 230 nm[11]。以峰面积y作为纵坐标，标准系列溶液质量浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线。石斛酚的回归方程为y=13.045x+0.5187,R2=0.9997。

图5 石斛酚标准曲线

2.4.2 石斛酚样品的测定

精密称取本实验2.1.2项下制得的石斛酚样品 50 mg，置于 100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至 100 mL。其余同2.4.1“石斛酚标准曲线的绘制”项下操作方法，测定石斛酚的含量。

3 结论

利用冷浸-超声、乙醇回流提取、醇沉返溶等方法对铁皮石斛中石斛多糖、石斛碱、石斛酚进行了联合提取，所得石斛多糖、石斛碱、石斛酚的纯度分别为89%、12%、27%。对铁皮石斛的主要活性成分石斛多糖、石斛碱、石斛酚的联合提取，流程简单，工艺可靠，能耗低，生产成本低等优势。为铁皮石斛有效成分的综合利用提供一定的参考依据。