低能氮离子注入诱变大肠杆菌对多粘菌素B的耐药研究*

蔡长龙，王 婷，唐 朝，钱卫东

(1.西安工业大学 光电工程学院,西安 710021；2.陕西科技大学 食品与生物工程学院,西安 710021)

近年来，随着抗生素在牲畜养殖和临床治疗中的大量使用，微生物多重耐药(Multidrug Resistance，MDR)与泛耐药(Pandrug Resistance，PDR)问题逐年加剧[1-2]。多粘菌素(Polymyxin)是多粘类芽孢杆菌产生的一种多肽类窄谱抗生素，对于治疗多重耐药，特别是碳青霉烯类多重耐药的革兰氏阴性细菌感染有较好的效果，被认为是治疗大肠杆菌等革兰氏阴性菌感染的最后防线[3]。但是随着多粘菌素作为促生长剂在畜牧生产中的推广应用，我国致病性大肠杆菌中多粘菌素耐药株及耐药基因mcr-1检出率呈爆发式增长。其中18个省猪粪源大肠杆菌中mcr-1的携带率高达45.0%～100%；禽致病性大肠杆菌中mcr-1的检出率从5.2%增长到30.0%，而30个省和自治区健康个人样本中mcr-1的阳性率为3.7%～32.7%,严重威胁公共卫生和人民健康[4-6]。

自然界中雷电、火山爆发等过程产生大量低能离子，这些低能离子通过能量沉积、电荷转移和交换等效应，使得生物体遗传物质产生突变，促进生物进化[7-8]。本文前期研究发现低能离子注入介导获得的31株重组沙漠寡营养细菌(DOB)的全基因组及16S rRNA 基因均发生了不同程度的突变，其中突变株DOB073中有21个新基因与抗生素抗性相关[9-12]。多重耐药转移蛋白(MdtM)可通过外排泵系统将进入胞内的抗菌药物泵出胞外，从而使菌体内的药物浓度降低，导致耐药[13-14]。但低能离子是否能诱变大肠杆菌16S rRNA的序列突变和MdtM基因表达量改变，从而获得耐药性，目前尚未有报道。

因此，文中通过不同能量的低能N+注入的方式诱变大肠杆菌ATCC25922获取变异菌株库，以抗性平板筛选对多粘菌素耐药的菌株，采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定诱变菌株耐药表征的变化，并通过PCR和测序分析诱变菌株16S rRNA的序列差异和MdtM基因的表达变化，为探索低能氮离子注入是否参与大肠杆菌多粘菌素耐药的形成机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌 株

大肠杆菌(Escherichia Coli,E.Coli)ATCC-25922， 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 材料和试剂

FOX30、CTX30、MXF5等抗生素药敏片(d=6 mm)，Mueller-Hinton Broth(MH)培养基购自OXOID公司；多粘菌素B购自生工生物工程(上海)股份有限公司；细菌gDNA提取试剂盒、 2×Taq Master Mix与琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 仪器和设备

生物改性离子注入装置，西安工业大学离子束生物工程及生物多样研究中心；全波长扫描式多功能读数仪，美国Thermo Fisher公司；电泳仪和梯度PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大肠杆菌活化及种子培养

将斜面保存的大肠杆菌参考株ATCC25922接种MH肉汤，于37 ℃，160 r·min-1活化培养24 h，取活化菌液划线接种MHA 平板，于37 ℃培养24 h， 挑取单菌落进行常规鉴定，鉴定后接种斜面扩大传代2次，即得大肠杆菌种子。

1.3.2 不同密度大肠杆菌的菌膜制备

取大肠杆菌种子接种MH肉汤，于37 ℃，200 r·min-1，培养至对数生长期，6 000 r·min-1离心5 min，PBS洗涤3 次，用无菌水将菌悬液分别稀释至1×106，1×107，1×108和1×109CFU·mL-1，随后分别取100 μL菌悬液涂布于无菌培养平皿(直径为9.0 cm)中，无菌风吹干形成菌膜。

1.3.3 低能N+注入剂量对大肠杆菌存活率的影响

大肠杆菌的低能N+注入诱变在生物改性离子注入装置上进行，设置具体参数为：N+离子源注入能量为15 keV，样本靶室真空度为10-3Pa，N+注入剂量分别为25×1014、50×1014、75×1014、100×1014、125×1014ions·cm-2，每个剂量下设置平行的真空对照。注入完成后，向注入板和真空板分别加入1 mL MH肉汤进行复苏，取复苏液以100 μL/板涂布MHA平板，37 ℃培养24～72 h，记录平板菌落数，计算大肠杆菌存活率。

1.3.4 K-B 法鉴定大肠杆菌耐药表征

参考CLSI标准判定指南M100(2020版)[15]采用纸片扩散法(K-B法)鉴定大肠杆菌耐药表征：大肠杆菌接种MH肉汤，于 37 ℃，200 r·min-1培养到对数期，用PBS洗涤，MH肉汤重悬，调整菌液为0.5麦氏标准浊度，取100 μL悬液涂布MHA平板，将药敏纸片(OXOID)紧贴于MHA平板表面，于 37 ℃倒置培养16～18 h，测定其抑菌圈直径，根据M100标准判定抑菌表征。

1.3.5 肉汤稀释法检测多粘菌素对大肠杆菌MIC

向96孔深孔板中加500 μL 1×106CFU·mL-1的大肠杆菌悬液，加入2倍比稀释的多粘菌素500 μL/孔，使药物终浓度分别达到64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25 和0 μg·mL-1，于37 ℃，200 r·min-1培养16～20 h，酶标仪读取各孔菌液OD600，判定多粘菌素B对大肠杆菌的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。

1.3.6 低能N+离子诱变及耐药突变株的筛选

根据1.3.2和1.3.3结果优选的菌膜密度和注入剂量对大肠杆菌ATCC2592菌株进行低能N+注入诱变，诱变后菌株涂布MHA平板，37 ℃培养24～72 h，记录平板菌落数，并通过平板转印含4×MIC浓度多粘菌素B的MHA平板(MHA-PB+平板)，筛选对多粘菌素B耐药的大肠杆菌突变菌株，将突变菌株继续在MHA-PB+平板传代3次，以获得稳定传代的耐药突变株，并对该菌株的耐药表征和菌种特征进行鉴定。

1.3.7 耐药大肠杆菌16S rRNA基因的序列变化

按照 DNA 提取试剂盒提取大肠杆菌DNA做模板，并按照PCR 扩增试剂盒操作指南进行PCR扩增。具体反应体系为：PCR Master Mix(2×) 10 μL，引物各 0.5 μL(引物序列如表1)，模板1 μL 的，补ddH2O 至 20 μL ；PCR 的反应程序：95 ℃ 5 mim→94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，重复30个循环→72 ℃ 10 min。利用琼脂糖凝胶电泳分析大肠杆菌中16SrRNA 基因扩增情况，扩增片段大小正确的送上海生工有限公司进行测序，用NCBI-blast对测序结果进行对比分析。

表1 引物序列

1.3.8 耐药大肠杆菌MdtM基因表达的变化

按照Trizol提取试剂盒提取大肠杆菌总RNA，并立即按照反转录试剂盒进行反转录，具体程序42 ℃ 15 mim→85 ℃ 5 s，以转录得到的cDNA为模板参照1.3.7配置PCR扩增反应体系，进行PCR扩增并利用琼脂糖凝胶电泳分析大肠杆菌MdtM基因表达的基因表达情况。

1.3.9 数据统计分析

每组实验均设3 组平行，结果采用平均数±标准差(Mean±SD)表示，用SPSS 20.0软件和Origin2018进行数据统计分析和图片绘制。

2 结果和分析

2.1 大肠杆菌的形态鉴定

将大肠杆菌参考菌株、诱变耐药菌株，临床分离耐药菌株分别划线接种麦康凯平板，菌落均呈红色，扁平、边缘整齐的圆形，且革兰氏染色为粉红色短杆菌(直径为∅0.5 μm，长度为1～3 μm)，初步鉴定为大肠杆菌，证明实验无污染(图1)。

图1 大肠杆菌ATCC25922革兰氏染色鉴定

2.2 不同密度菌膜和不同注入剂量对大肠杆菌存活率的影响

当低能N+注入靶室真空度为10-3Pa，N+离子源注入能量15 keV时，不同密度大肠杆菌菌悬液制备成的菌膜对低能N+注入剂量的敏感性不同。结果如图2所示，当菌膜密度≤1×107CFU·mL-1时，各个剂量N+注入后，大肠杆菌存活率都较低，甚至无菌落出现；当菌膜密度≥1×108CFU·mL-1时，大肠杆菌的存活率随着注入剂量增加，呈现先下降后上升再下降又上升的马鞍形，在注入剂量为100×1014ions·cm-2时，细菌的存活率达到二次高峰，为15.99%，根据低能离子束辐射生物效应的“反常辐照损伤”原理[7-8]，确定后续低能N+注入诱变的菌膜密度为1×108CFU·mL-1，诱变剂量为100×1014ions·cm-2。

图2 注入剂量与密度对E.coli存活率影响

2.3 出发菌株ATCC-25922的耐药表征

应用K-B法对大肠杆菌的耐药特征进行检测，结果出发菌株ATCC-25922对多数β内酰胺类的阿莫西林/克拉维酸(AMC3)、头孢西丁(FOX30)和头孢曲松(CRO5)；对氟喹诺酮类的左氧氟沙星(LEV5)和莫西沙星(MXF5)；对阿奇霉素(AZM15)、庆大霉素(CN30)和多粘菌素B(PB30)等抗生素都敏感(S)，无耐药(R)现象。微量肉汤稀释实验结果证实 ATCC-25922对多粘菌素B敏感，其MIC为6.25 μg·mL-1。

2.4 低能N+注入诱变大肠杆菌耐多粘菌素耐药株

以15 keV注入能量，100×1014ions·cm-2注入剂量对1×108CFU·mL-1的ATCC-25922进行低能N+注入，结果诱变后得到4976个诱变菌株，存活率为15.95%，通过平板转印MHA-PB+平板(PB=25 μg·mL-1)，72 h后平板共计长出8个菌落，且传代3次后仍有3个突变株能在 MHA-PB+平板生长，说明低能N+注入能诱变大肠杆菌获得多粘菌素B抗性，突变率为0.06%。将其依次命名为25922-PB1、25922-PB2和25922-PB3。

2.5 低能N+注入诱变耐药菌株的耐药表征变化

药物敏感性实验结见表2，与常用抗生素对出发菌株ATCC-25922形成的抑菌圈相比较，MXF5、LEV5和PB30对诱变菌株25922-PB1的抑菌圈直径减少；CRO30和PB30对诱变菌株25922-PB2的抑菌圈直径减少；CRO5、AMC3、MXF5、AZM15和PB30对诱变菌株25922-PB3的抑菌圈直径减少。说明诱变菌株25922-PB1，25922-PB2和25922-PB3对于PB由敏感(S)转为耐药(R)，并获得了对其它抗生素的多药耐药特性(如图3所示)。

表2 大肠杆菌耐药谱

图3 大肠杆菌抑菌圈直径

2.6 低能N+注入诱变耐药菌株的MIC变化

筛选获得的耐PB菌株25922-PB1、25922-PB2和25922-PB3，对PB的MIC分别增加为100 μg·mL-1、25 μg·mL-1和50 μg·mL-1，其耐药指数(Resistance Index,RI)分别为16、4和8；说明低能N+注入使参考株ATCC25922获得了耐PB的特征(图4)。

图4 多粘菌素B对大肠杆菌的MIC

2.7 大肠杆菌16S rRNA的扩增和分析

对大肠杆菌分别进行16S rRNA基因扩增，凝胶电泳鉴定，得到大约1600bp扩增片段(图5(a))。将扩增产物送上海生工生物技术有限公司测序，测序结果用NCBI的Blast分析发现，耐药株29522-PB1、PB2和PB3的16S rRNA与参考株ATCC-25922差异性分别为7.2%、0.2%和8.1%，其中耐药菌株29522-PB1和29522-PB3与ATCC25922差异性较高(图5(b))。

图5 大肠杆菌16SrRNA基因扩增结果和同源性分析

2.8 大肠杆菌的MdtM基因的扩增和分析

通过对大肠杆菌分别进行MdtM基因RT-PCR扩增，凝胶电泳鉴定，仅耐药株29522-PB1扩增得到大约1233bp扩增片段(图6)，其余菌株均未扩增出MdtM基因片段，说明29522-PB1株可能由于低能N+离子注入导致自身基因或其调控因子基因突变，从而表达量增加，出现肉眼可见扩增条带。

图6 大肠杆菌MdtM基因扩增结果

3 结 论

1) 文中通过低能N+注入诱变大肠杆菌 ATCC25922，确定了低能N+注入诱变大肠杆菌的最佳菌膜浓度为1×108CFU·mL-1，最佳注入剂量为100×1014ions·cm-2。以优化剂量诱变大肠杆菌ATCC25922，筛选获得3株耐多粘菌素B的诱变菌株29522-PB1、29522-PB2和29522-PB3，其耐药指数为4～16倍。基因分析表明耐药菌株的16S rRNA突变率达到0.2%～8.1%(以ATCC25922为参照)，其中菌株29522-PB1和29522-PB3的突变率较高，且29522-PB1中MdtM基因表达量上调，而MdtM属于外膜通道蛋白，可增强菌体对多粘菌素B等药物的外排作用，导致大肠杆菌对药物耐受性增强。

2) 文中研究结果说明低能N+注入可以引发大肠杆菌16SrRNA基因的突变和进化，从而引发其耐药基因的突变和表达量改变，为探索低能离子注入介导大肠杆菌的耐药发生机制提供参考。