Gstm3在何首乌苷延缓SH-SY5Y细胞衰老中的作用

吴德静，范 芳，陈佳瑜，葛正龙

(遵义医科大学 基础医学院生物化学与分子生物学教研室，贵州 遵义 563099)

衰老是一种不可抗拒的自然规律，生物体的衰老发生在机体的各个层面，包括细胞、组织及器官，而细胞是生命的基本组成单位，细胞衰老被认为是人类衰老的基础[1]。

何首乌苷(2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，TSG)是传统中药何首乌的主要活性成分，具有多种生物活性和药用价值，包括抗衰老、抗氧化(通过清除自由基)、抗高胆固醇血症、抗动脉粥样硬化、抗炎、保肝和抗肿瘤作用等[2]。何首乌的抗衰老机制可以通过调节和增强机体的免疫功能，清除衰老动物体内自由基和抗氧化作用来达到抗衰老延年作用[3-4]，但具体分子机制还未明了。Gstm3(谷胱甘肽硫转移酶 M3)是一种 II 期转移酶，有研究指出，Gstm3与许多氧化应激及年龄相关疾病的发病机制有关[5-6]，但在细胞水平上探讨Gstm3在何首乌苷延缓衰老中的作用还未见报道。本研究以SH-SY5Y细胞为研究对象，通过转染Gstm3干扰载体下调Gstm3的表达，进而探讨Gstm3在何首乌苷延缓SH-SY5Y细胞衰老中发挥的作用及可能的机制，为探索何首乌苷延缓衰老的作用靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人神经母细胞瘤细胞株 SH-SY5Y，购自北纳生物公司。

1.2 药物与试剂 何首乌苷(成都埃法生物，批号：AF21042756)；胎牛血清(BI，批号：2106043)；DMEM培养基(美国Gibco，批号：8121340、8121308)；Anti-β-Tubulin、Anti-Gstm3 antibody、Anti-Bax antibody、二抗山羊抗兔(武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为：00090708、00047625、50599-2-Ig、20000258)；Anti-Bcl-2 antibody(沈阳万类生物科技有限公司，批号：L12161556)；D-半乳糖、二抗稀释液、RIPA 裂解液、5% BSA 封闭液(北京索莱宝科技有限公司，批号分别为：SLCH96、MB9888-Aug-04F、20201126、20210609)；CCK-8 试剂盒(碧云天生物技术，批号：061521210723)凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGA1024)；超敏ECL化学发光试剂盒(Millipore,批号：2017801);蛋白Marker(美国Thermo，批号：01003978)；TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(日本Takara，批号：AJF2575A)；Gstm3shRNA 载体类型：pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO。

1.3 仪器 Western blot 电泳仪、实时荧光定量 PCR 仪、全自动化学发光凝胶成像系统(美国 BIO-RAD 公司)；酶标仪(Bio-Tek公司)；荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；核酸定量仪(美国Thermo公司)；二氧化碳培养箱(日本松下公司)；电热恒温培养箱、震摇型加热金属浴(上海一恒公司)；低温高速离心机(德国艾本德公司)、-80℃超低温冰箱(澳柯玛公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 将SH-SY5Y细胞从液氮中取出，细胞复苏后移入细胞培养瓶，并加入DMEM完全培养基(含青霉素100 IU/mL、链霉素100 mg/mL、10%FBS)4 mL，放入细胞培养箱(5% CO2，37℃)中孵育。培养至细胞长满培养瓶底部约 80%～90% 时进行传代后，置于培养箱中继续培养备用。

1.4.2 细胞转染及Gstm3干扰载体的筛选 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，按5×105个/(2 mL·孔)的密度接种于6孔细胞培养板，当细胞生长至孔板面积70%时，移去6孔板中的原培养基，并加入1 mL含polybrene(终浓度为3 μg/mL)的无FBS的DMEM培养基，根据病毒滴度和细胞量加入相应体积的病毒原液，培养箱(5% CO2，37℃)孵育4 h后每孔补充1 mL含10% FBS的完全培养基。转染24 h后，移去6孔板中含病毒的培养基，换上无病毒的含10% FBS完全培养基，培养箱中继续培养。设置分组为：空白对照组(NC)、阴性对照组(shNC)、Gstm3-shRNA1组(sh1)、Gstm3-shRNA2组(sh2)和Gstm3-shRNA3组(sh3)，每组均设 3 个平行样。转染48 h后，在荧光倒置显微镜下观察细胞，绝大部分细胞被转染上病毒，移去6孔板中的培养基，换上浓度为3 μg/mL含puromycin培养基(含10%FBS)培养1周，进行后续实验。随后收集细胞，提取 RNA和蛋白，筛选沉默效率最高的干扰载体，后续试验将转染该组的SH-SY5Y细胞设为Gstm3沉默组(shGstm3-P/D组)。

1.4.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测Gstm3 mRNA水平 提取转染后及药物处理后的各组细胞总RNA，进行逆转录得到cDNA，实时荧光定量PCR进行反应，反应体系为20 μL，以GAPDH为内参。反应条件为 95 ℃预变性10 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增40循环。绘制扩增曲线和融解曲线，采用2-ΔΔCT法计算mRNA表达水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物序列见表 1 所示。

1.4.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中Gstm3、Bcl-2、Bax蛋白表达 收集细胞，加入一定量含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度，制备成上样蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至 PVDF 膜，5% BSA室温封闭1h后，用 Gstm3、Bcl-2、Bax、β-Tubulin 抗体(1∶2 000，1∶1 000，1∶4 000，1∶5 000)置于4 ℃冰箱孵育过夜，再用相应的HRP标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗膜，经ECL反应，最后采用BIO-RAD ChemiDocTMtouch imaging System 检测蛋白条带ECL化学发光信号，并用 ImageLab 软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白的相对含量=目的条带灰度值/对应 β-Tubulin 灰度值。

1.4.5 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞端粒长短 将NC组、D-Gal组、P/D组、shGstm3-P/D组细胞按实验方案给与何首乌苷和D-Gal处理后，应用细胞DNA提取试剂盒提取各组细胞基因组DNA后，实时荧光定量PCR进行反应，反应体系为12 μL，以36B4为内参。端粒PCR反应条件：95 ℃预热10 min；95 ℃，15 s，69 ℃，1min，69 ℃收集荧光，40个循环。内参PCR反应条件：95 ℃预热10 min；95 ℃，15 s，62 ℃，1 min，60 ℃收集荧光，40个循环。绘制扩增曲线和融解曲线，采用2-ΔΔCT法计算mRNA表达水平。引物序列见表1所示。

表1 RCR引物序列

1.4.6 CCK-8检测细胞活力 将NC组、D-Gal组、P/D组、shGstm3-P/D组细胞以2×104cells/孔的密度接种于96孔板中，且每孔加入100 μL DMEM完全培养基，同时设无细胞的空白对照孔，每组6个平行样。先用2 μg/mL何首乌苷处理各组细胞24 h后，再用200 mM D-Gal和何首乌苷共同处理48 h，处理结束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱中孵育1 h，用酶标仪检测各组细胞在450 nm处的吸光度A值，并根据A值计算细胞活力。

1.4.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的空白对照组(NC-P/D，SH-SY5Y细胞)、阴性对照组(shNC-P/D)和Gstm3沉默组(shGstm3-P/D)细胞系，按5 × 104个/(2 mL·孔)接种至 6 孔细胞培养板培养过夜，每组3个平行样。按实验方案给予何首乌苷和D-Gal处理后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集细胞后，用PBS洗涤细胞二次(离心1 000 r/min，5 min)；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；再加入5 μL Annexin V-APC混匀后，加入5 μL 7-AAD，混匀；于室温避光反应15 min；用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。

2 结果

2.1Gstm3干扰载体的筛选 qPCR和WB检测结果显示，Gstm3-shRNA1组SH-SY5Y细胞中Gstm3 mRNA和蛋白表达水平最低，且较NC组和shNC组明显降低(P<0.01，见图1)。荧光倒置显微镜下观察显示，转染Gstm3干扰载体的SH-SY5Y 细胞生长状态良好，可见绿色荧光蛋白表达，转染效率较高(见图2)。筛选出沉默效率最高的 Gstm3-shRNA1 进行后续试验。

A：mRNA表达情况；B:蛋白表达情况；*、**：与 NC 和 shNC 组比较，P<0.05，P<0.01；n=3。

图2 慢病毒转染SH-SY5Y荧光鉴定

2.2 转染Gstm3干扰载体后SH-SY5Y细胞中Gstm3 mRNA和蛋白水平的表达 结果显示，与NC-P/D组和shNC-P/D组比较，shGstm3-P/D组中Gstm3的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，见图3。

A：mRNA表达情况；B:蛋白表达情况；**、***：与 NC-P/D 和 shNC-P/D 组比较，P<0.01，P<0.001；n=3。

2.3 何首乌苷对携带Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y细胞端粒长度的变化 结果显示，与NC组比较，D-Gal组端粒长度明显缩短(P<0.05)；与D-Gal组比较，P/D组端粒长度明显增加(P<0.05)；而与P/D组比较，shGstm3-P/D组端粒长度明显缩短(P<0.01)，见图4。

*：与NC组比较，P<0.05；#：与D-Gal组比较，P<0.05；**：与P/D组比较，P<0.01；n=3。

2.4 何首乌苷对携带Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y细胞活力的影响 结果显示，与NC组比较，D-Gal组细胞活力明显下降(P<0.001)；与D-Gal组比较，P/D组细胞活力明显升高(P<0.01)；而与P/D组比较，shGstm3-P/D组细胞活力明显下降(P<0.001)，见图5。

**：与D-Gal组比较，P<0.01；***：与NC组比较，P<0.001；###：与P/D组比较，P<0.001；n=3。

2.5 何首乌苷对携带Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 结果显示，与NC-P/D组及shNC-P/D组比较，shGstm3-P/D组SH-SY5Y细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显降低，促凋亡蛋白Bax的表达水平明显升高(P<0.05)，见图6。

*：与NC-P/D组和shNC-P/D组比较，P<0.05；n=3。

2.6 何首乌苷对携带Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y细胞凋亡率的影响 结果显示，与NC-P/D组及shNC-P/D组比较，shGstm3-P/D组SH-SY5Y细胞凋亡率增加(P<0.001)，见图7。

***：与NC-P/D组和shNC-P/D组比较，P<0.001；n=3。

3 讨论

衰老是一个普遍的过程，伴随着认知和身体损伤的逐渐累积以及患多种疾病的风险增加，包括癌症、糖尿病及神经退行性疾病等。因此，探索衰老本质和寻求抗衰老的方法、药物的研究已成为当今热门课题。何首乌(Polygonum multiflorum thunb，PM)是一种传统中草药，具有乌发，强筋骨，补肝肾，延年益寿等作用，何首乌苷(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，TSG)是从PM中提取的主要活性成分之一，已被证明具有很强的抗氧化和清除自由基的活性，在抗衰老和抗衰老相关疾病治疗中表现出多种生物学功能[7-8]。Gstm3属于超基因酶家族，参与毒素和酶的II期解毒，可消除氧化应激相关产物，已被证实参与多种肿瘤及年龄相关性疾病如白内障、阿尔茨海默病、骨关节炎等的发生发展[9-12]，并且与细胞凋亡密切相关[13-14]，但对于Gstm3在何首乌苷延缓衰老中的作用及可能的机制研究还未见报道。

慢病毒干扰技术能够高效、特异地沉默基因的表达，是重要的下调基因的手段之一，该技术已得到广泛应用[15-17]。本研究以SH-SY5Y细胞为基础，通过转染Gstm3干扰载体成功下调Gstm3表达，探讨Gstm3在何首乌苷延缓SH-SY5Y细胞衰老中的作用及可能的机制，为探索何首乌苷延缓衰老的作用靶点提供实验基础。qPCR和WB检测结果显示，Gstm3-shRNA1组SH-SY5Y细胞中Gstm3 mRNA 和蛋白表达水平最低，且较NC组和shNC组明显降低，故选取沉默效率最高的Gstm3-shRNA1进行后续试验，同时观察携带Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y细胞中Gstm3 mRNA和蛋白水平的表达变化，结果显示，下调Gstm3后，shGstm3-P/D组SH-SY5Y细胞Gstm3 mRNA和蛋白水平降低。

目前判断细胞衰老的指标有端粒长短、细胞活力及活性氧等。端粒是存在于染色体末端的基因序列，作为衰老的生物标志物，随着年龄的增长长度逐渐缩短[18-19]，同时细胞衰老时会出现细胞活力下降[20]。为了探讨Gstm3在何首乌苷延缓细胞衰老中的作用，本研究观察了下调Gstm3后对细胞的端粒长短和细胞活力的影响。结果显示，与NC组比较，D-Gal组端粒长度明显缩短，细胞活力下降；与D-Gal组比较，P/D组端粒长度明显增加，细胞活力升高；而与P/D组比较，shGstm3-P/D组端粒长度明显缩短，细胞活力明显下降，说明Gstm3参与了何首乌苷延缓SH-SY5Y细胞的衰老。

细胞衰老与细胞凋亡密切相关，表现为凋亡相关蛋白及细胞凋亡率的增加[21-24]。而细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，对正常的生物体发育、组织维持和整体生物体稳态至关重要[25]。在调控细胞凋亡的过程中，抗凋亡蛋白Bcl-2在细胞周期的任何阶段均可抑制细胞凋亡，促凋亡Bax蛋白作为Bcl-2家族的一个重要成员，在凋亡途径中可与抗凋亡蛋白结合并抑制其活性，降低Bcl-2/Bax 的比值而启动细胞凋亡[26-27]。为进一步了解Gstm3在何首乌苷延缓SH-SY5Y细胞衰老中可能的机制，对三组细胞(NC-P/D组、shNC-P/D组、shGstm3-P/D组)给予何首乌苷和D-Gal处理后，观察携带Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax蛋白水平的表达变化和细胞凋亡率的变化。结果发现，shGstm3-P/D组细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，促凋亡蛋白Bax的表达增加，同时流式细胞术凋亡结果显示，shGstm3-P/D组细胞的凋亡率较NC-P/D组及shNC-P/D组明显增加，上述结果提示Gstm3参与了何首乌苷延缓SH-SY5Y细胞的衰老，这一过程可能与凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达及细胞凋亡率变化相关。

综上所述，本研究表明Gstm3参与了何首乌苷延缓SH-SY5Y细胞的衰老，这一过程可能是通过降低抗凋亡蛋白的表达，增加促凋亡蛋白的表达以及提高细胞凋亡率来实现，但确定Gstm3是否是何首乌苷延缓衰老的作用靶点还有待进一步研究。