黏液卡红复染在诊断艾滋病合并隐球菌脑膜炎中的应用

陈 蓉，张立新，万利霞，周 虹，阮连国，张 丽，洪 可

隐球菌脑膜炎(cryptococcal meningitis, CM)是由隐球菌引起的机会性感染，与获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)(又称艾滋病)密切相关[1]。全球每年因CM死亡的艾滋病患者约18万，占艾滋病总死亡人数的15%。我国属于艾滋病低流行国家，由于我国人口基数大艾滋病合并CM的患者较多。CM起病隐匿且临床表现缺乏特异性，早期确诊困难，易误诊，导致病死率及致残率增加[2]。本文探讨黏液卡红复染法对艾滋病合并CM的诊断价值，为细胞病理学的微生物诊断提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集2016年10月～2019年12月武汉市金银潭医院存档的128例脑脊液细胞涂片。选取其中同时有脑脊液真菌培养及墨汁染色，或隐球菌抗原检测结果的首次送检病例75例纳入研究，其中36例为艾滋病合并CM作为CM组，39例艾滋病无脑膜炎或合并其他脑膜炎作为非CM组。非CM组中无脑膜炎18例，合并结核性脑膜炎4例，合并病毒性脑膜炎8例，合并神经梅毒6例，合并脑梗塞3例。临床诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准中艾滋病及艾滋病毒感染诊断WS293-2019》和2018年5月《中华内科杂志》“CM诊治专家共识”。

1.2 方法(1)真菌培养：无菌吸管吸取脑脊液1～2滴滴入肉汤培养48 h，后接种于沙保罗氏琼脂平板(广州凯林公司)，放入(35±1) ℃含5%～10%CO2的孵箱中孵育，2天后观察；同时吸取1～2滴滴入沙保罗氏斜面培养基孵育1周。有真菌生长，则行真菌鉴定，任意一种阳性均为阳性。(2)脑脊液墨汁染色：取1滴脑脊液滴于干净玻片上，滴1滴墨汁(珠海贝索公司)覆盖脑脊液，盖上盖玻片在显微镜下观察，见透亮隐球菌，包括菌体和较宽的荚膜，或菌体出芽判为阳性。(3)隐球菌荚膜抗原检测：采用美国Immuno-Myologics有限公司生产的隐球菌抗原检测试剂盒(胶体金免疫层析法)。(4)黏液卡红复染：将已行刘氏染色，并滴加医用石蜡油诊断后的脑脊液涂片流水稍洗，75%乙醇30 s脱色，水洗，染色步骤按“黏液卡红染色液”试剂盒(珠海贝索公司)说明书操作。已复染的玻片每例由2位病理医师分别判读，作出3种判读结果：阴性、阳性、不确定(1～5个红色隐球菌)。

1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料以例数和百分数表示，采用χ2检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料36例艾滋病合并CM者，男性34例，女性2例，年龄21～74岁，平均38.8岁。患者以头痛和(或)头晕或意识障碍为最常见症状(88.9%，32/36)，其次是发热(63.9%，23/36)和呕吐(27.8%，10/36)；91.7%(33/36)的患者CD4+T细胞计数为每微升<100个，脑脊液压力≥200 mmH2O占72.2%(26/36)；入院期间死亡或危重放弃治疗的患者达25%(9/36)。

2.2 黏液卡红复染镜下特征脑脊液细胞涂片脱色后黏液卡红复染背景较原刘氏染色背景干净，隐球菌呈团片状或散在分布，荚膜显示鲜红色，其轮廓清楚，呈大小不一的类圆形，可见葫芦样出芽，易与具有蓝色细胞核的淋巴细胞等其他细胞鉴别(图1～3)，病理医师易判读。复染玻片中红染的隐球菌或棋盘样成群，或一大一小相连出芽，或散在单个。

图1 A.刘氏染色示隐球菌、淋巴细胞及杂质均着蓝色；B.黏液卡红复染后隐球菌红色，淋巴细胞蓝色，背景杂质不着色 图2 A.刘氏染色示隐球菌不着色或着浅蓝色，红细胞灰色；B.黏液卡红复染后隐球菌鲜红色，红细胞淡黄色 图3 A.黏液卡红复染示淋巴细胞中见一个红色的隐球菌；B.黏液卡红复染示棋盘样分布的红色隐球菌，见出芽，散在3个蓝色淋巴细胞

阳性片整片隐球菌数量不低于10个，阴性片几乎无红色菌体干扰，所检测的病例中未出现不确定病例。

2.3 不同染色结果的一致性分析75例脑脊液细胞涂片黏液卡红复染诊断艾滋病合并CM的敏感性为94.4%(34/36)；特异性为100%(39/39)。脑脊液培养敏感性为77.8%(28/36)，特异性为100%。脑脊液墨汁染色敏感性为11.1%(4/36)，特异性为100%。其中65例同时有脑脊液隐球菌荚膜抗原检测结果，其敏感性为96.2%(25/26)，特异性为100%(39/39)。脑脊液黏液卡红复染同真菌培养相比差异无统计学意义(P>0.05)；同隐球菌荚膜抗原检测相比差异无统计学意义(P>0.90)；同墨汁染色相比差异有统计学意义(P<0.005，表1)。

表1 脑脊液黏液卡红复染与真菌培养、墨汁染色及隐球菌荚膜抗原检测的对比分析

3 讨论

3.1 艾滋病合并CM的临床表现及实验室检查CM是由隐球菌感染中枢神经系统引起的炎症性病变，其临床症状无特异性，主要表现为发热、渐进性头痛、精神和神经症状，常与其他中枢神经感染的症状重叠，易误诊[2-3]。与国内文献报道相似，本组36例CM中，主诉头痛和(或)头晕或意识障碍的患者最多；CD4+T细胞计数每微升<100个占91.7%，提示对于CD4+T细胞计数每微升<100个细胞，出现头痛、头晕或呕吐的艾滋病患者，应行腰椎穿刺排除CM[3]。

2010年我国“隐球菌感染专家共识”指出，脑脊液墨汁染色、培养和隐球菌荚膜多糖抗原乳胶凝集试验结果中的任一个阳性均可确诊隐球菌中枢神经系统的感染；同时，患者的临床症状、体征和脑脊液常规、生化以及影像学检查对诊断具有重要价值[4]。国内文献指出，脑脊液墨汁染色可以早期、快速诊断CM，但是诊断的敏感性不一，从首次的44%至多次检验的100%，常依赖于观察者的经验和技术水平[2-3]。本组病例中脑脊液墨汁染色的敏感性偏低(11.1%)，回顾性分析发现该结果与实验室分检样本量偏少和检验者经验不足有关。脑脊液隐球菌培养是确诊CM的“金标准”，但培养耗时较长，敏感性亦较低，同时治疗过程中培养结果转阴较为迅速，并不能依此判断隐球菌已经完全丧失活力[2]。本组病例的脑脊液真菌培养敏感性为77.8%，稍高于国内的文献报道，应该与同一样本双培养有关[3]；培养出现7例假阴性，其中5例在外院疑似CM已行抗真菌治疗，2例是多次行脑脊液培养后才证实为CM，提示抗真菌治疗后会影响培养结果。脑脊液隐球菌荚膜抗原检测对CM的诊断具有较好的敏感性，可用于早期诊断，但存在假阳性反应，也不能作为评估是否治愈的指标[3]，受限于病例数较少和条件限制，基层医院多未常规开展该检测。

3.2 脑脊液细胞涂片黏液卡红复染的病理学诊断隐球菌在体外为无荚膜或仅有小荚膜，进入人体内后很快形成厚荚膜，具有荚膜的隐球菌菌体增大，致病力明显增强[4]。黏液卡红染色是传统的组织病理特殊染色方法，操作简单，原理是卡红与媒染剂铝形成螯合物，其分子带正电荷能与低密度的酸基质如黏液类物质结合呈红色。隐球菌的荚膜属于黏液物质，能被卡红染成红色，阳性即可确诊，其他真菌无黏多糖荚膜，所以黏液卡红染色对隐球菌诊断具有特征性[5]。

脑脊液细胞涂片黏液卡红复染后，玻片背景较原刘氏染色干净，淋巴细胞及中性粒细胞胞核呈蓝色，胞质不着色或淡灰色，红细胞呈淡灰色或淡黄色；隐球菌荚膜显示鲜红色，类圆形，轮廓清楚。涂片中隐球菌数量多时，呈棋盘样成群成片分布，菌体大小不一，可见典型一大一小葫芦样出芽；数量偏少时，隐球菌三五成群或散在单个分布，大者比淋巴细胞大，小的不及中性粒细胞的单个分页核。

复染后隐球菌易与脑脊液中的人体细胞及其他微生物鉴别。病理医师易判读，阳性片满视野可见红色菌体，部落样成群分布，数量大；阴性片几乎无红色颗粒，红细胞呈类圆形，着淡灰色或黄色，需注意鉴别；当全片出现少数散在红色菌体样颗粒，无典型出芽菌体时，需谨慎判读，以防止污染后出现假阳性结果。

3.3 黏液卡红复染诊断CM的可信度和优势本组数据显示，黏液卡红复染诊断艾滋病合并CM具有较高的敏感性(94.4%)和特异性(100%)；其敏感性稍高于真菌培养，特异性同真菌培养和隐球菌荚膜抗原检测，差异均无统计学意义；但明显优于传统的墨汁染色。

临床诊断性抽取脑脊液样本量少，送检病理科的样本仅能离心制片1张满足常规细胞病理诊断，黏液卡红复染利用已完成的细胞病理诊断涂片，不增加样本或再次送检，实现病理学对隐球菌脑膜炎的微生物诊断。当临床初诊为其他脑炎，未送检隐球菌实验室相关检验，或其他原因未实现CM的诊断时，细胞病理黏液卡红复染可实现隐球菌微生物学补救性诊断。

综上所述，艾滋病合并CM起病隐匿，临床表现无特异性，基层医院条件受限，及时诊断存在一定的困难[2]，脑脊液细胞涂片黏液卡红复染可实现CM微生物学诊断，适合推广应用。值得注意的是，临床的早期判断和腰椎穿刺、组织病理学、影像学、药物观察等多学科合作可使患者最大程度的获益。