接触辉光放电等离子体对紫花苜蓿种子萌发的促进作用及处理工艺

徐毓鸿 龙海涛 王婷 董文科 薛华丽 蒲陆梅

1（甘肃农业大学理学院 兰州 730000）

2（甘肃农业大学草业学院 兰州 730000）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是一种多年生豆科植物，是世界上种植面积最大的苜蓿属植物。其适应性强、产量高、营养丰富，茎叶中蛋白质［1］、矿物质、氨基酸、维生素等含量丰富。成熟期收获的干草中富含P、K、Ca、Mg 等微量元素［2］，素有“牧草之王”一称［3］。近年来，过度放牧造成草场退化，导致耕地产量低下，严重影响农牧业发展。虽然紫花苜蓿具有良好的生态适应性，但因其上种皮表层含有致密的疏水蜡状物，阻碍水分的吸收，抑制种子萌发与生长［4］，导致其有出苗困难等问题。因此种子在播种前需要预先处理，提高其萌发率及生物产量，创造更好的经济效益与社会价值。

目前，促进豆科植物种子萌发的方式主要有机械磨皮、热水浸种、酸蚀处理和碱液浸泡［5］。然而，酸蚀与热处理促进种子的萌发效果因品种及处理措施而异，若处理不当，会引起种子损伤，甚至丧失发芽能力［6］；利用化学药剂会造成土壤污染以及植株损伤［7］。因此，对种子进行安全且不污染环境的改良处理尤其重要。近年来，非热等离子体（Nonthermal plasma，NTP）技术在种子播种前处理方面的应用越来越广泛［8］。其非化学的处理方式有效地避免了化学试剂对种子的伤害，为减少农药使用量、减轻环境的污染提供了新的解决方案。常见的处理方式有介质阻挡放电（DBD）、大气压等离子射流放电（APPJ）、电晕放电（CD）等。尽管处理装置不同，但NTP产生的机制存在普遍共识［9］：放电环境下产生活性氮氧物种（RONS），例如O、O2-、H2O+、·OH 等活性粒子以及O3、NOx、H2O2等稳定分子，通过产生的带电粒子的撞击、活性物种的影响以及辐射与电场等物理因素作用于生物材料。现已应用在拟南芥［10］、大麦［11］、小麦［12］、甜椒［13］以及绿豆［14］等种子上，对种子表面抑菌具有显著效果，同时影响种子的萌发、生长、抗逆性、酶活性以及DNA变化等［8］。

接触辉光放电等离子体（CGDP）［15］是一种新兴的NTP 方法：与水溶液接触的电极在高压直流电的作用下发生辉光放电，阴阳两极共同与水分子作用产生O2-、H2O+、OH-、·OH、O3、H2O2等高能活性粒子。即包含自由基物种的等离子体活性粒子在溶液界面形成，不断向溶液中扩散，从而诱导溶液中物质发生反应［16］。目前，已在合成化学、废水处理、有机降解、光敏和催化表面材料等领域有着广泛的研究及应用［17］。然而，关于影响种子萌发的研究尚未见报道。本实验以陇东紫花苜蓿种子为研究对象，通过Box-behken 实验设计，以萌发率（Gr）与活力指数（Vi）为评价指标，将等离子体处理种子的时间、电压以及气体环境作为考察因素，优化CGDP 处理种子的工艺。进而为提高苜蓿种子的萌发提供一种可行、有效的处理方式，为探索CGDP促进种子萌发及幼苗生长提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

陇东紫花苜蓿种子由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室提供。选择饱满均一的供试种子，预先进行消毒。首先用浓度为75%乙醇溶液浸泡30 s，接着用2%的次氯酸钠浸泡5 min，置于室温下晾干，消毒后将供试样品放入无菌袋里密封保存备用。

1.2 CGDP装置

CGDP 装置由直流高压电源（0～1 000 V）和反应器两部分组成，反应装置示意图见图1。阴极为电极长度10 cm、直径10 mm的石墨棒；阳极为电极长度10 cm、直径0.5 mm的铂丝。为确保反应器中的温度恒定，反应器外附有循环冷却水系统。调整两电极极距，使电流控制在（27±2）mA内［18］。将种子置于等离子体体系中进行处理，磁力搅拌促使等离子体中活性成分与种子充分接触。

图1 实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of experimental equipment

1.3 方法

1.3.1 CGDP处理种子

选择时间、电压、气体环境3个直接影响辉光放电的重要条件进行单因素实验。常压大气540 V电压条件下，分别进行15 min、30 min、45 min和60 min 处理，以研究处理时间对种子萌发的影响。常压大气处理30 min 条件下，分别进行500 V、520 V、540 V、560 V、580 V和600 V处理，以研究处理电压对种子萌发的影响。在540 V电压、处理时间30 min 的条件下，分别通入常压大气、O2和N2，以研究气体环境对种子萌发的影响。

1.3.2 种子的萌发与指标测定

根据Roy 的方法［19］采用纸培法培养，测定相关萌发指标。每组样品含30 粒苜蓿种子，将种子均匀放入直径90 mm、内含双层滤纸的培养皿容器中，加入3.5 mL 无菌水，利用密封膜封口来防止水分蒸发。置于恒温恒湿光照箱中模拟光照，光照强度为54 μmol/（m2·s）（16 h 光照，8 h 黑暗），湿度50%～60%。每天补水以保持第一次培养时滤纸的润湿程度，培养7 d，每组平行实验3 次。根长1 mm以上，且胚芽鞘伸出时认定种子发芽。每天记录种子的发芽数，连续3 d无新发芽的种子为止。由公式（1）、（2）、（3）计算萌发率（Gr）、萌发指数（Gi）和活力指数（Vi）。

式中：N7、Nts、Ntg、Gd、Lt分别为7 d 内种子发芽数、供试种子的总数、种子t天的萌发数、萌发天数以及苗长，mm。

1.3.3 叶绿素含量

准确称取20.0 mg 叶片，参照舒展的方法［20］，利用丙酮提取法提取待测液，测定吸光值（OD）。利用Arnon公式［21］（4）～（7）计算提取液中叶绿素a 浓度（Ca，mg/L）、叶绿素b 浓度（Cb，mg/L）、叶绿素总浓度（Ca+b，mg/L）、类胡萝卜素浓度（Cx.c，mg/L），然后用公式（8）换算为每克鲜叶光合色素含量（Cp，mg/g）。

式中：A645、A663、A470分别为波长645 nm、663 nm、470 nm 下的吸光度；V表示提取液总量，mL；W为鲜叶重，g。

1.3.4 叶片光合气体交换参数

利用GFS-3000 便携式光合作用仪测定紫花苜蓿分枝期叶片第50 天的光合速率。分别分析了气孔导度（Gs，mmol/（m2·s））、蒸腾速率（Tr，mmol/（m2·s））、胞间CO2浓度（Ci，μmol/mol）、净光合速率（Pn，mmol/（m2·s））等光和作用参数，并按公式（9）、（10）计算水分利用效率（WUE）和叶片气孔限制值（Ls）［22］。

式中：Co表示外界CO2浓度。

1.3.5 响应面优化

根据单因素实验结果，以处理时间（A）、电压（B）、气体环境（C） 3个因素进行三因素三水平的Box-Benhnken design 实验。Gr以及Vi为响应值R1，R2。以得到等离子体装置处理苜蓿种子的最优条件。响应面的实验因素与水平设计如表1所示。

表1 Box-Behnken实验因素与水平Table 1 Factors and level of Box-Behnken experiment

1.4 数据处理与分析

每组平行实验均3次进行。数据处理、数据绘制分别利用Desian-Expert11.1.01和Origin2019软件进行。使用SPSS 26软件进行单因素方差分析和邓肯检验评估各组之间的差异，并在p＜0.05 时认为具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 时间、电压和气体环境对萌发指标的影响

各单因素实验的Gr以及播种后4 d的生长趋势见图2，单因素对种子萌发的影响见图3。随着处理时间的增加，苜蓿种子的Gr、Gi与Vi等相关萌发指标呈先上升后下降趋势。经过30 min 的处理，各指标均达到最佳值，分别为对照组（0 min）的1.08倍、1.10倍和1.15倍，因此处理30 min后的种子活力最强。处理30 min 后，随着处理时间的延长各数值明显下降。甚至处理45 min 后与对照组相比活力指数（Vi）下降了3.6 倍。Los 等［23］的研究发现，将处理时间延长到一定时间会对小麦的生物参数产生一些负面影响，种子发芽率下降；Măgureanu［24］的实验结果表明，处理时间过长不利于生长，处理45 min 后番茄苗长的增长开始逐渐降低，这与我们的实验结果一致。氧化还原生物化学中，活性氮（RNS）和活性氧（ROS）对植物有重要的调节作用。等离子体产生的RONS通过附着在粗糙的种皮表面，扩散到内部，从而提高了种子储备化合物的氮含量，对促进种子萌发十分重要。Billah 等［25］的研究结果表明，介质阻挡放电（DBD）大气等离子体处理，使黑豆种子中氮复合物含量增加，从而使发芽速度加快，氮复合物含量与黑豆种子的发芽率呈正相关关系。然而，长时间处理会导致过度氧化和氮胁迫［26］，一旦超出植物体内抗氧化酶的调节范围，例如过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化酶（APX）、过度的H2O2以及RONS 胁迫，就会造成威胁或毒害，降低发芽能力，是种子失活的主要原因［27］。综上所述，确定处理时间30 min为最佳处理条件。

图2 播种4 d后单因素对萌发率以及生长趋势的影响：(a)时间；(b)电压；(c)气体环境Fig.2 Influence of single-factor on germination rate and growth trend after 4 d of sowing：(a)time；(b)voltage；(c)gas environment

图3 单因素对紫花苜蓿种子萌发指标的影响：(a)时间；(b)电压；(c)气体环境Fig.3 Effect of single factor on germination index of Alfalfa：(a)time；(b)voltage；(c)gas environment

当电压为540 V时，相对于其他电压条件时各项萌发指标达到最大值。萌发率高达90%，萌发指数与活力指数较对照组相比分别增长1.34 倍和1.49倍。而当电压超过540 V后，各项指标均随着电压的增大而大幅下降，甚至萌发率降低了4.1倍。这与徐文倩等［4］的研究结果一致：当电压增加到一定程度后，苗长出现一定程度的降低。等离子体处理时，会通过氧化损伤影响植物代谢。对于化学胁迫，植物的保护机制依赖于抗氧化酶的活性［24］，抗氧化酶主要包括APX、CAT 和超氧化物歧化酶（SOD）等。Billah［28］研究结果表明，低压介质阻挡放电（LPDBD）等离子体使水稻植株整体抗氧化酶活性（APX、CAT、SOD）增强，产生清除ROS 的酶，有助于调节抗氧化酶防御系统，增强渗透调节能力，有助于植株的生长发育。另外，等离子产生的活性化合物还会与相关内源激素（生长素，细胞分裂素等）［29］协同作用，加速种子内部营养物质的分解，刺激了细胞的分裂和增殖，加速细胞伸长，促进幼苗生长［30］。而过强的电压产生的ROS 含量过高，一旦超出植物细胞抗氧化酶的最大调节范围，就会导致细胞与组织损伤，与生物生长量呈现负相关关系［31］。因此确定540 V为最佳电压进行下一步的实验。

氮气环境使种子相应的萌发指标均有显著提高。特别是活力系数（Vi），氧气环境下仅为344.0，常压空气下为564.4，而氮气环境下高达1 382.0 左右，相比于其他两组气体环境下增长了1.5～3.0 倍。选用氮气作为载气可以避免初始浓度的活性氧，例如·OH、O2-，这些活性物质具有很高的氧化电位，会对植物造成不利影响。特别是过量的臭氧，据报道，臭氧浓度过高会导致植物细胞膜损伤和溶质泄露，直接影响种子的萌发与生长［32］。因此，综合考虑选择氮气作为处理的最佳气体环境。

2.2 响应面实验

2.2.1 设计与结果

以单因素实验为基础，利用Design Expert11设计Box-Behnken。以时间、电压、气体环境为响应变量A、B、C，Gr、活力指数为响应值R1、R2，结果见表2。通过多元回归拟合数据，得到二次多项回归方程式（11）和（12）。

表2 响应面设计方案及结果Table 2 Box-Behnken design and results

响应值的回归方程方差分析如表3所示，Gr及Vi二次回归模型的p＜0.05，失拟项p＞0.10，表明模型显著，无失拟因素存在；相关系数R2分别为0.989 6、0.914 5，校正系数R2Adj分别为0.966 6、0.804 5，即自变量与响应值之间关系显著，实验结果分别为96.66%、80.45%，受实验因素的影响，模型可以准确反映拟合实验的真实情况。因此，该模型可以由两个响应值Gr与Vi的结果进行分析和预测。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

回归模型方差分析表明，F值检验可以确定自变量影响下因变量的大小，因此各因素对发芽率（R1）影响的主次顺序依次是是C、B、A，即气体环境影响最大，其次是电压，最后是时间。一次项C、交互项AB、AC、BC和二次项B2、C2对萌发率的影响均达到极显著水平（p＜0.01），二次项A2对萌发率的影响极其显著（p＜0.000 1）。结果表明：各实验因素与响应值之间的关系并不仅是单纯的线性关系，而是各因素间存在显著的交互作用关系；影响活力指数（Vi）的因素主次顺序分别为处理时间、处理电压、气体环境。交互项AB、二次项A2、B2、C2对活力指数的影响达到极显著水平（p＜0.01），是影响活力系数的重要模型项。

2.2.2 响应面交互分析

为直观反映实验各因素相互交互对响应值的影响结果，利用二次回归方程绘制等高线以及三维响应面。响应面越陡峭说明因变量对响应量影响越大。图4为三因素之间交互作用对Gr影响的响应面图，图5为三因素交互作用对Vi的响应面图。

图4 各种因素交互作用对发芽率影响的等高线和响应面图Fig.4 Contour and response surface diagram of the interaction of various factors on germination rate

图5 各种因素交互作用对活力指数影响的等高线和响应面图Fig.5 Contour and response surface diagram of the interaction of various factors on the vivo index

图4 中处理时间与电压交互的响应面坡度陡峭，这表明A、B因素交互作用影响紫花苜蓿种子的发芽率较强；图5 中，A和B之间因素交互作用明显，其他因素之间交互作用不明显，例如：处理时间（A）与气体环境（C）对种子活力系数交互影响较弱，响应面坡度平缓。这与方差分析的结果一致。

2.2.3 最佳处理条件验证

由响应面软件优化的等离子体的最佳处理条件为：时间30.03 min、电压534.62 V、气体环境0.317 8，在该条件下萌发率和活力指数的预测值分别为92.931%以及1 869.63。综合实际考虑，调整最佳处理条件为：时间30 min、电压540 V、气体环境为N2。采取最佳条件处理的验证实验的种子相关萌发参数见图6。与对照组相比，等离子体处理后紫花苜蓿种子的萌发率增长了8.26%。Gi反映了种子的发芽速率和整齐程度，是决定种子萌发效果的重要指标，处理后的Gi增加了14.50%。另外，处理组的Vi较对照组相比升高了36.7%，为1 710.81。各项指标与对照组相比均显著增加，与预测值相符。因此表明可利用该模型对条件进行响应面优化。

图6 验证实验种子的萌发参数Fig.6 Seed germination parameters for verification test

2.4 CGDP对光合作用特性的影响

图7～8分别表示CGDP对苜蓿叶片光合色素含量以及光合作用的影响。图7显示，在最佳优化条件下，等离子体处理使叶片的光合色素的含量均有所增加，其中，Ca+b含量发生显著变化。相较于对照组叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素以及类胡萝卜素含量分别增加25.41%、25.46%、25.42%以及39.65%。光合色素含量增加，表明等离子体处理可以提高苜蓿植株的生理活性，能够直接促进植物的光合作用。由图8可知，苜蓿叶片的净光合速率（Pn）显著高于对照组，其增加幅度为98.39%。

图7 CGDP对苜蓿叶片中光合色素含量的影响Fig.7 Effects of CGDP on photosynthetic pigment content in alfalfa leaves

图8 CGDP对光合作用的影响：（a）气孔导度；（b）蒸腾速率；（c）胞间CO2浓度；（d）净光合速率；（e）水分利用效率；（f）叶片气孔限制值Fig.8 Effects of CGDP on photosynthesis：(a)stomatal conductance；(b)transpiration rate；(c)intercellular CO2；(d)net photosynthesis rate；(e)water use efficiency；(f)stomatal limitations of leaves

气孔导度（Gs）为平衡气体交换，也发生了显著变化，相比于对照组提升43.04%。植株会利用气孔将细胞内的水分以水蒸气的形式散发出去产生蒸腾效应［21］，因此，Gs会影响植物的蒸腾速率（Tr）。CGDP 处理后，Tr提高了41.59%，Gs与Tr的大幅增大，加速了植物与外界间气体交换，进一步增加植物细胞对CO2的利用率，最终显著增加了植物的光合作用。WUE也显著提高，增长了40.72%，说明在消耗相同单位重量的水情况下，CGDP会使苜蓿拥有更高的干物质量及生物量，创造更好的生产效益。

胞间CO2浓度没有明显变化，气孔限制值（Ls）有所增加。说明气孔调节并不是导致光合速率增加的主要原因，而是由于产生CGDP的过程中选择N2作为气体环境，RNS 提供了丰富氮源，使种子中氮复合物的含量增加。等离子为种子提供足够的氮源，可以通过氮复合体的代谢产生足够的蛋白质与氨基酸，提供种子所需的营养，促进幼苗生长，对提高叶绿素含量发挥着至关重要的作用［28］。另外，由于植株中氮积累量增加，与氮代谢和光合作用有关的硝酸盐还原酶和谷氨酰胺合成酶的活性增加，最终促进植株的光合作用［19］。这一观察结果与Billah［28］的研究结果一致，低压介质阻挡放电（LPDBD）使水稻幼苗叶片中叶绿素含量发生了显著变化。因此，说明CGDP可以提高植株的生物活性，高效地促进体内光合色素的产生，进而提高植株的光合速率，最终促进生长，产生更高的经济效益。

3 结论

CGDP具有促进紫花苜蓿种子萌发以及幼苗生长的作用。CGDP影响种子萌发的3个主要因素为处理种子的时间、产生等离子体的电压以及气体环境。各因素与种子的萌发和生长有良好的响应关系。本文确定CGDP促进紫花苜蓿种子的最佳工艺为：N2环境、540 V电压、处理30 min。该条件下萌发率高达93%，活力指数为1 869.6。辉光放电等离子体不仅能显著促进紫花苜蓿的萌发，还使其幼苗叶片中光合色素含量显著增加，提高植株光合作用，最终促进作物生长。因此，接触辉光放电等离子体是一种合理、可行、有效的种子前处理方法。对紫花苜蓿种子的萌发和幼苗生长有显著促进作用。

作者贡献说明徐毓鸿是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；王婷、董文科、薛华丽参与实验设计和试验结果分析；蒲陆梅、龙海涛是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。所有作者均已阅读并认可该论文最终版的所有内容。