“美酒”白掌茎尖培养及组培快繁技术

吴贤彬，黄明翅，夏 晴，宿庆连，曾伟达，周晓云

（广州花卉研究中心，广东 广州 510360）

“美酒”白掌（Spathiphyllum kochii ‘mojo’）是白掌的一个栽培品种，其花叶具有较高的观赏价值，且株型娇小、耐阴，又具有净化室内空气的功效［1］，适合家庭及办公场所摆放，深受广大消费者的喜爱，其市场前景广阔。

茎尖培养并进行组培快繁是获得优质种苗的重要途径，该技术已应用于部分作物［2-3］、果蔬［4-5］、花卉［6-8］种苗的繁殖生产中。目前。关于白掌组培快繁的研究报道较多，常用叶片、叶柄、顶芽、茎段、花梗、花序等组织或器官作外植体，表面消毒难度均较高，污染率介于10%～87%之间［9］，外植体损耗大，且经过多代培养后，易产生内生细菌而影响其后续增殖及成苗质量。白掌茎尖被叶柄紧密包裹，受环境污染的影响较小，但剥取困难。目前，关于白掌茎尖离体培养和快繁的研究鲜有报道。因此，研究“美酒”白掌茎尖离体培养技术，对提高其外植体利用率、生产优质种苗具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选取广州花卉研究中心生长健壮、无病虫害的2年生“美酒”白掌。

1.2 试验方法

1.2.1 茎尖消毒 将整株切下，留茎段（带4～5片叶柄）约5 cm，冲洗、晾干。用0.6%含氯消毒溶液（以君鸿牌消毒粉配制，其有效氯质量分数为18%～21%）振荡清洁40 min，期间换1次消毒液；再用去离子水冲洗干净，在无菌条件下剥去2片叶柄，加入0.1% HgCl2溶液再分别浸泡消毒4、8和12 min；用灭菌去离子水冲洗6次，吸干水分，剥取直径1～2 mm茎尖，测量其基部直径，并培养于1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基上，每处理10个茎尖，3次重复。培养30 d后统计其污染茎尖数，并计算污染率；40 d后测量茎尖基部直径，计算茎尖生长量。计算公式如下：

污染率（%）=污染茎尖数/茎尖总数×100%

茎尖生长量（mm）=培养后茎尖基部直径（mm）-培养前茎尖基部直径（mm）

1.2.2 茎尖培养 将灭菌茎尖培养在不同基本培养基（MS、1/2MS、1/4MS）、含不同浓度细胞分裂素（6-BA、KT）、含不同浓度生长素（NAA、IBA、IAA）培养基中，每处理接种6个茎尖，3次重复。培养40 d后测量茎尖基部的直径，并计算茎尖生长量。测量后转接至1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基继续培养，直至分化出丛生芽。

1.2.3 丛生芽增殖培养 将丛生芽以单芽、双芽、三芽和四芽的团块接种培养在不同基本培养基（MS、3/4MS、1/2MS），并添加0.6 mg/L 6-BA和0.02 mg/L NAA的培养基中，每瓶培养基4个芽团，每处理5瓶，3次重复。培养40 d后统计其丛生芽数，并计算丛生芽增殖率。

将丛生芽以单芽形式培养在分别含6-BA（0.6、1.0、1.5 mg/L）与生长素（0.02、0.05 mg/L NAA，0.1 mg/L IBA）的9种3/4MS培养基上，每瓶4个单芽，每处理5瓶，3次重复。培养40 d后统计其丛生芽数，并计算丛生芽增殖率。计算公式如下：

丛生芽增殖率（%）=培养后丛生芽总数/接入芽总数×100%

1.2.4 生根培养 当植株达到3 cm高，并且具有3片叶时，将切除根的植株培养在分别添加0.5 mg/L生长素（NAA、IBA、TRP）的1/2MS培养基中诱导生根。每瓶10株，每处理5瓶，3次重复。培养15、30 d后各统计1次生根植株数，计算生根率。计算公式如下：

生根率（%）=生根植株数/接入植株数×100%

1.2.5 移栽 生根培养30 d后，将生根苗的瓶盖拧松，放置在温室内炼苗7 d；取出苗并洗净，移栽于填满泥炭基质（0～20 mm）的72孔穴盘中，在温室温度为（26±2） ℃、空气相对湿度约为80%的条件下栽培；分别于培养7、35 d时测量株高及统计叶片数，计算其株高生长量及叶片的增加数。

切取株高大于4 cm，且具有3片叶以上、2条根的丛生芽带根单株，在同样条件下栽种、管理与测量，计算株高生长量及叶片增加数。计算公式如下：

株高生长量（mm）=培养35 d的株高（mm）-培养7 d的株高（mm）；

叶片增加数=培养35 d的叶片数-培养7 d的叶片数

1.3 培养条件

茎尖在光强6 μmol/（m2·s）条件下培养7 d后，转入光强为25～30 μmol/（m2·s）的条件下培养。光照时间为10 h/d，温度为（24±2） ℃，空气相对湿度为60%。

丛生芽增殖、生根均在光强为25～30 μmol/（m2·s）的条件下培养。其他条件同茎尖培养。

1.4 数据分析

数据以平均数±标准误（SE）表示，采用Excel 2016、SPSS 19软 件 进 行 统 计 分 析，应 用Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 茎尖消毒

由表1可知，茎尖经0.6%含氯消毒溶液浸泡40 min后，再用0.1% HgCl2分别消毒4、8和12 min，表面菌类基本被杀灭，同时茎尖均存活，仅4 min处理的出现1个污染，说明该消毒方法有效；但随着消毒时间的增加，茎尖生长逐渐减缓，表明0.1% HgCl2消毒时间长对茎尖生长有一定的抑制作用，但差异不显著。因此，选择0.1% HgCl2消毒4 min，这样既能有效杀灭茎尖表面的菌类，同时也对茎尖生长的影响较小。

表1 0.1% HgCl2不同消毒时间对茎尖生长的影响

2.2 茎尖培养的影响因素

2.2.1 基本培养基对茎尖生长的影响 由表2可知，培养于MS和1/2MS上的茎尖生长量显著大于培养于1/4MS上的，且培养于1/2MS上的茎尖生长量最大，为3.66 mm。这表明不同浓度基本培养基对茎尖生长量有显著影响，适合于茎尖生长的基本培养基是1/2MS，高浓度或低浓度都不利于茎尖的生长。

表2 基本培养基对茎尖生长的影响

2.2.2 细胞分裂素对茎尖生长的影响 由表3可知，适量的6-BA和KT均适合“美酒”白掌茎尖生长，但对茎尖生长量的影响差异不显著。在1/2MS+0.6 mg/L KT+0.1 mg/L IBA培养基上，其茎尖生长量最大，为3.22 mm，与0.2 mg/L 6-BA和KT处理相比，更能促进茎尖生长。

表3 细胞分裂素对茎尖生长的影响

2.2.3 生长素对茎尖生长的影响 由表4可知，培养在1/2MS+0.6 mg/L KT+0.1 mg/L IBA上的茎尖获得了最大生长量，达到2.81 mm，显著大于培养在1/2MS+0.6 mg/L KT+0.1 mg/L NAA 上的。这表明IAA、IBA在促进茎尖生长方面优于NAA，且低浓度IBA也优于高浓度IBA。将所有茎尖培养在1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基上2个周期（80 d），大部分茎尖可以分化出丛生芽。

表4 生长素对茎尖生长的影响

2.3 丛生芽增殖的影响因素

2.3.1 基本培养基与接种不同芽团对丛生芽增殖的影响 由表5可知：在3/4MS上培养的丛生芽增殖率最高，平均为3.41，且以双芽接种的最高（4.04）；在不同基本培养基上接种单芽和双芽的平均增殖率分别为3.41和3.38，显著高于接种四芽的；单芽接种于MS上的高于另外3种芽团类型，且与3/4MS上的差异不显著。由此表明，不同浓度基本培养基与接种不同芽团对“美酒”白掌丛生芽增殖具有显著的影响，且其丛生芽增殖以单芽接种培养于MS上或双芽接种培养于3/4MS上较为合适。

表5 基本培养基与接种不同芽团对丛生芽增殖率的影响

2.3.2 生长调节剂对丛生芽增殖率的影响 由表6可知，培养于1.5 mg/L 6-BA上的丛生芽增殖率最高，平均为3.31，显著高于培养在另外2个浓度水平的处理。培养于IBA上的丛生芽增殖率为3.07，略高于培养在NAA上的，但不同浓度及类型生长素对丛生芽增殖影响差异不显著。结果表明：不同浓度6-BA与生长素配比对“美酒”白掌丛生芽增殖具有显著影响。培养在3/4MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基上的丛生芽，其增殖率最高，为3.49，优于或显著优于其他配比下的培养基。

表6 6-BA与生长素配比对丛生芽增殖率的影响

2.4 生长素对生根的影响

由表7可知，不同生长素及生根时间对丛生芽生根的影响不同。在3种生根培养基上，培养15 d后的丛生芽生根率均超过50%，30 d后的生根率可达90%以上。生根培养15 d后，TRP诱导丛生芽的生根率最高，为66.43%，显著高于NAA的培养基，但生根培养30 d，差异不显著，说明TRP更有利于丛生芽生根。

表7 生长素对生根率的影响 %

2.5 生长素对移栽后组培苗生长的影响

由表8可知，用IBA生根的苗移栽35 d后其株高生长量最大，为1.38 cm；与应用NAA（1.04 cm）、TRP（0.84 cm）生根，以及带根丛生芽单株（0.90 cm）直接移栽的差异显著。经生根培养的组培苗移栽35 d后均长出2片新叶，显著高于直接移栽的。结果表明：应用IBA、NAA生根，对组培种苗移栽初期（35 d）株高和长新叶均有一定的促进作用。

表8 生长素对移栽后组培苗生长的影响

3 结论与讨论

建立白掌快繁体系所用外植体有花序［10-12］、顶芽［13-15］、侧芽［16-18］、茎段［19-20］、叶片和叶柄［21］，其污染率低的有10%，高的可达87%，损耗了大量的外植体。增加消毒时间可降低污染率，但会影响其存活率、生活力［9］。本试验采用1～2 mm的茎尖建立“美酒”白掌的无菌系，茎尖消毒成功率达到97%以上，充分利用、节省了外植体。在建立无菌系的过程中，用顶芽、侧芽诱导丛生芽相对于用叶片、叶柄诱导愈伤组织产生不定芽更容易，且变异率更低［16］。叶片和花梗难以诱导出芽，而侧芽和茎段是最合适的外植体［22］。刘晓青等［23］认为芽诱导产生丛生芽的增殖方式具有遗传稳定性高的优点。在本试验中，茎尖培养120 d后即诱导出丛生芽，经多代增殖培养，未发现可见变异，可见芽增殖方式的遗传稳定性较高。

在白掌快繁体系中，顶芽（茎尖）、腋芽常见的初代培养配方是MS+1.5～2.0 mg/L 6-BA+0.1～0.2 mg/L NAA［13-19］。本试验发现，培养1～2 mm的茎尖，KT优于6-BA，且低浓度就能让茎尖较好地生长；观察发现长大的茎尖能很好地诱导出丛生芽而不产生愈伤，这有利于降低后期芽增殖产生变异的可能。

白掌生根使用IBA、NAA或两者搭配，生根率在95%以上，两者混合生根优于IBA，且IBA的生根效果又优于NAA［16］。本试验得出了类似结论，并发现TRP的生根效率优于IBA、NAA，但移栽后，小苗在株高生长量及叶片数增加上均不如IBA和NAA，其原因有待进一步试验研究。

白掌在增殖过程中根芽同步生长，可省去生根过程，缩短组培周期，节省生产成本［24-25］。本试验发现，“美酒”白掌在增殖过程中能根芽同步，带根丛生芽单株在温室栽培条件下移栽存活率可达100%。对组培生根苗和带根丛生芽单株进行移栽比较发现，移栽35 d内，生根苗的生长速度显著快于带根丛生芽单株小苗。可见，白掌在组培过程中省去生根过程，能节省成本，但会显著影响组培苗移栽后初期的生长，其可能原因是丛生芽单株移栽初期，小苗未能适应环境的改变。若在增殖末期增加1～2周的时间，以炼苗环境条件来培养增殖芽，则带根丛生芽单株可能达到生根苗移栽的相似效果，从而实现缩短其组培生产周期、节约生产成本且不影响苗生长的目标。