辣椒细胞质雄性不育系小孢子败育的细胞学形态鉴定

雷 刚，周坤华，陈学军，黄月琴，袁欣捷，方 荣

（江西省农业科学院 蔬菜花卉研究所，江西 南昌 330200）

0 引言

辣椒（Capsicum annuum L.）是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一，年种植面积超过210万hm2，总 产 量6400多 万t［1］。辣 椒 果 实 中 含 有 丰 富 的辣椒素、辣椒碱、维生素、辣椒色素、有机酸、蛋白质、糖和矿物质等多种功能性成分，除了应用在食品行业外，还被用于饲料、化妆品、工业染料、医药及军事等行业［2-3］。辣椒属于常异花授粉植物，具有较强的杂种优势，F1代杂交种子比常规种早期增产达50%左右，全生育期产量增加30%～50%［4］。但目前人工杂交制种不仅存在成本高、授粉效率低、种子纯度难以保证等问题，而且亲本材料容易流失［5-7］，利用细胞质雄性不育系（cytoplasmic male sterile，CMS）进行杂交制种可有效解决这一难题。

有关辣椒CMS小孢子败育细胞学的研究已有诸多报道，小孢子败育的时期因材料的不同而异，败育现象从造孢细胞时期之后每个阶段都有发生［8］。掌握败育发生的时期和成因对于雄性不育的转育和在生产上的应用意义重大。本研究通过对辣椒CMS B351A及其保持系B351B的小孢子发育的细胞学形态进行比较和鉴定，确定不育发生的时期，推测其发生的细胞学机制，进而为B351A花药败育发生的分子生物学研究和不育性状育种应用提供参考和理论指导；同时，对小孢子发育时期与对应花蕾外观形态特征的相关性进行分析，旨在确定从花蕾的形态特征来判断其小孢子发育时期的标准，为辣椒小孢子培养接种材料和分子生物学研究材料的便捷选取提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试辣椒细胞质雄性不育系材料B351A（S/rfrf）及其保持系B351B（N/rfrf），由江西省农业科学院蔬菜花卉研究所茄果类蔬菜课题组发现并选育。B351A的细胞质来源于2007年在试验田发现的细胞质雄性不育植株，其花药为紫色、干瘪皱缩，开裂后无花粉，柱头外露，雌蕊发育正常；其保持系B351B的花药也为紫色、饱满，开裂后花粉量大（图1）。

图1 辣椒雄性不育材料B351A（A）及其保持系材料B351B（B）的花器官形态

材料于2020年2月中旬播种，每个材料播100粒种子，苗期昼夜温度设为（28±2）℃/（15±2）℃，光周期12 h，光照强度180 μmol/（m2·s），相对湿度（65±5）%。3月下旬定植于试验温室，管理同常规生产。

1.2 试验方法

1.2.1 花蕾的测量及形态描述 于盛花期早上8：00～9：00采集不同大小（纵径2.00～8.00 mm）的花蕾。花蕾的测量采用游标卡尺，分别测量花蕾纵径，即花蕾基部至花冠伸出点/花冠顶端的长度；横径，花萼中部位置横切面的直径；花冠长度，花冠漏出花萼部分的长度。对花蕾外观形态，如花萼形态、花冠形态、色泽等进行描述。

1.2.2 花药小孢子发育的细胞学观察 （1）固定：取辣椒雄性不育材料B351A及其保持系B351B经过测量的花蕾，用镊子小心剥去花萼、花冠露出花药后迅速置于电镜固定液中（2.5%戊二醛，0.1 mol/L磷酸缓冲液，pH值为7.0～7.5）固定，并用真空泵抽气直至沉底，室温放置2 h，后转入4 ℃冰箱，随后用0.1 mol/L磷酸缓冲液PB（pH值为7.4）漂洗3次，每次15 min。

（2）后固定：用1.0%的锇酸·0.1 mol/L磷酸缓冲液PBS（pH值为7.4）室温固定5 h，随后用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值为7.4）漂洗3次，每次15 min。

（3）脱水与透明：将固定好的组织分别用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精进行脱水，每次1 h。将脱水后的组织材料置于无水乙醇∶丙酮为3∶1、1∶1和1∶3（v∶v）的溶液中分别透明0.5 h，最后置于丙酮溶液中1 h。

（4）渗透与包埋：利用丙酮∶812包埋剂=3∶1（v∶v）渗 透3 h，丙 酮∶812包 埋 剂=1∶1（v∶v）渗透过夜，丙酮∶812包埋剂=1∶3（v∶v）渗透3 h，纯812包埋剂渗透6 h；将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37 ℃烤箱过夜，随后转60 ℃烤箱聚合48 h。

（5）切片：采用徕卡的超薄切片机Leica UC7切片，切片厚度1～2 μm。

（6）染色：将甲苯胺蓝染液放入烤箱60 ℃加热，将切片置于染液中浸染2 min，随后用蒸馏水洗2 min，95%酒精分化，在光镜下控制颜色，烤干后用中性树胶封片。最后采用日立HT7700电子透射电镜进行观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 不育系与保持系小孢子发育过程的细胞学形态观察比较

2.1.1 花粉母细胞时期（S1） 孢原细胞经过分裂形成了纤维层、中层、绒毡层和花粉母细胞。绒毡层细胞位于花药壁的最内层，排列整齐紧密，染色很深，造孢细胞则位于绒毡层的内侧，体积较大（图2A）。此时期，不育系与保持系花药在细胞结构和形态上没有明显的差异（图2B）。

2.1.2 四分体时期（S2） 此时保持系花药中层细胞消失，其他各层细胞层次分明，绒毡层细胞体积大，细胞核大且着色深；花粉母细胞经过 2次分裂形成染色较深的胼胝质包裹的四面体结构（图2C）。而不育系花药室内未见四分体结构，可见一些形状不规则的花粉母细胞，中层细胞还清晰可见，部分绒毡层细胞明显液泡化且体积较大，挤压花药室，有的绒毡层细胞已经降解成为深色条块（图2D）。

2.1.3 单核期-单核靠边期（S3） 保持系小孢子细胞质中出现液泡，细胞核被挤压靠近细胞壁；绒毡层细胞已经开始退化（图2E）。此时不育系绒毡层已经完全降解成为深色条带；花药室受挤压变得狭小，未完成减数分裂的花粉母细胞也完全降解，与绒毡层细胞降解残渣粘连在一起形成深色条带（图2F）。

2.1.4 成熟花粉粒时期（S4） 此时保持系的花粉粒变的很圆，着色深，有的花粉粒可以看到萌发孔；绒毡层细胞几乎全部降解，仅有部分细胞残留物在花药室内壁上（图2G）。而不育系花药室内看不到成熟的花粉粒，仅可见解体的花粉母细胞和绒毡层细胞粘连在一起，形成着色很深的条带（图2H）。

图2 辣椒胞质雄性不育系B351A和保持系B351B小孢子发育过程

2.2 B351A和B351B小孢子发育各时期对应花蕾外观特征

通过电镜观察不同大小花蕾对应小孢子的发育时期，从表1可见，小孢子发育的时期与花蕾的纵径、横径、花冠长度及花萼、花冠色泽和状态有密切的关系。无论是不育系还是保持系，在花粉母细胞时期花萼紧紧包裹花冠；四分体时期花萼微微张开，漏出浅绿色的花冠，从S1到S2花蕾纵径增加不明显，但横径增加相对较大；单核靠边期（S3）花萼处于半抱合状态，花冠长度接近花萼长度，从S2到S3花蕾纵径和横径都明显增加；花粉成熟期花萼向外张开，花冠露出部分达花萼长度的1/2，中部鼓起，颜色黄白色，从S3至S4花蕾纵径和花冠长度增加最为明显，增加的长度主要是花冠长度增加所致，横径变化不明显（表1）。

表1 花药不同发育时期对应花蕾的外观形态和参数

3 讨论与结论

3.1 辣椒胞质雄性不育系B351A小孢子发生败育的时期

在被子植物中，一般单子叶植物小孢子败育多发生在双核期或靠近双核期，而双子叶植物多发生在四分体时期或小孢子早期［9］。就辣椒而言，花粉败育发生在花粉母细胞时期［10-13］、花粉母细胞减数分裂期［14-17］、四分体时期［18-22］、单核期［23-25］等的都有相关报道，这可能是基因型和不育类型的差异所致。本研究发现，在花粉母细胞时期，2个材料花药的细胞结构没有明显的差异（图2A、2B），但在四分体时期，B351A的绒毡层细胞退化明显，花药室内无四分体形成；随着花药继续发育，花粉母细胞逐渐发生分解、退化（图2F、2H），最终导致无小孢子产生而发生败育。因此，不育系B351A小孢子败育发生在花粉母细胞时期至四分体时期之间，即花粉母细胞减数分裂时，这与吴鹤鸣等［14-17］的研究结果相似，皆是在形成四分体前绒毡层细胞的异常或提前降解，导致无四分体或产生畸形的四分体结构而引起败育。绒毡层是花药壁的最内层结构，毗邻小孢子，为小孢子发育提供所需的营养物质、生长素和酶，并适时降解，为小孢子发育提供空间。绒毡层细胞与高等植物的花粉发育有着密切的关系，其结构异常，提早或延后降解都会导致花粉败育［26］。本研究中，B351B的绒毡层在四分体时期后开始降解，到花粉成熟期已完全降解，而B351A花药绒毡层在减数分裂期就提前降解，解体的细胞包裹着花粉母细胞，导致花粉母细胞营养不能减数分裂形成四分体结构，没有小孢子产生而发生败育。

3.2 辣椒小孢子发育时期与花蕾外观形态的关系

前人研究发现，辣椒花蕾色泽、纵径、横径，花药色泽、长、宽，花萼长及花瓣长等外观指标和形态特征与小孢子发育时期有密切关系，可作为通过外观形态判断小孢子发育时期，进行田间取样的依据［27-29］。本研究对辣椒CMS B351A及其保持系B351B的小孢子发育时期与花蕾外观形态特征进行了分析，研究结果表明，小孢子各发育时期与花蕾的一些外部形态特征关系密切。花粉母细胞时期或之前，花萼紧紧包裹花冠是最明显的特征；从花粉母细胞时期到四分体时期，花蕾横径增加最为明显，可能是此时花药纵向生长速度较快；四分体到单核期，花蕾纵径和横径都明显增加；当花冠长度接近花萼长度时，小孢子处于单核靠边期，但单核靠边期之后，花蕾横径几乎没变化，花冠的快速伸长导致了纵径大幅的增加。因此，可以根据花萼状态判断是否处于花粉母细胞期前后，根据花冠长与花蕾纵径比判断是否处于单核靠边期，这与张菊平等［27-30］报道的对应花蕾状态的小孢子发育有些许差异，这可能与所用的材料基因型不同有关。笔者认为，辣椒花蕾大小和外观形态不仅受基因型的影响，受环境影响也很大，研究结果对供试材料具有一定的指导意义，但不具有普适性。