一种MAP仿生粘合材料的合成线路优化与初步毒性评价*

成 昭 ，程诗雅，尉祎雯，冯凯茵，张雪娇

（西安医学院药学院,陕西西安710021）

在人工粘合材料的合成与应用研究中,目标材料的合成可修饰性与线路设计[1-2]、材料的粘合性能与生物相容性[3-4]一直是该领域研究的两个主要关注点。基于生物来源粘合材料,进行仿生合成设计与合成线路优化,一方面能够保证所合成材料的生物亲合性能,降低人工合成材料的细胞毒性及可能免疫应激反应,另一方面便于以合成设计思路调控材料结构、简化合成步骤,增强人工合成材料结构的可修饰性。同时,人工合成材料来源单纯,其结构与分子量均处于一定的可调控范围,相较于生物来源材料的复杂性[5],便于设计精准实验方案、系统考查合成材料的稳定性与毒性,建立仿生粘合材料在生命体环境中的安全性和适用性的系统评价参数。

贻贝依靠其丝足腺黏液,表现出强大的生物粘合性能[6]。贻贝分泌的生物粘合剂主要成分为贻贝粘合蛋白(mussel adhesive protein,MAP),其结构中包含高化学活性的粘合单元邻二酚[7],通过邻二酚在水环境中的离解与带电[8]、氧化与交联[9]等作用过程,实现贻贝在岩石、钢铁、玻璃等多种材料界面的稳定粘合[10-11]。基于仿生合成手段,设计在人工合成粘合剂中引入邻二酚粘合单元[12],降低合成材料的细胞毒性及可能免疫应激反应,改善人工粘合剂的粘附与生物相容性能。同时,引入具有较高化学修饰性的聚氨酯片段、简化合成步骤。通过高分子基体合成与粘合单元引入等合成步骤,得到一种新型MAP仿生粘合材料,并进行合成路线设计、材料热稳定性与细胞毒性考查,初步评价了该仿生粘合材料进一步应用于生命体环境的安全性和适用性[13]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：TENSOR T-27傅里叶变换红外分光光度计(德国BRUKER)；AVANCE Ⅲ超导核磁共振波谱仪(德国BRUKER,400MHz,溶剂DMSO-d6,内标TMS)；PLGPC50凝胶渗透色谱仪(美国Agilent Technologie)；PE-TGA7热失重分析仪(美国Perkin Elmer)；1510 Mwltiskan Go多功能酶联免疫检测仪(美国Thermo Fisher)。

试剂：异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)、聚丙二醇1000(PPG 1000)、二羟甲基丙酸(DMPA)、二丁基二月桂酸锡(DBTL)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、多巴胺盐酸盐、三乙胺等试剂,DMF、DMSO等反应溶剂,均为分析纯,购自阿拉丁试剂有限公司。

1.2 合成

通过扩链、偶联两步主要反应,合成得到一种新型MAP仿生粘合材料（图1）。

如合成路线图1所示,扩链过程首先经由1）IPDI氰键与PPG 1000羟基作用得到聚氨酯预聚物（化合物1）,再经2）化合物1与扩链剂DMPA、缩合剂DCC、催化剂DBTL共同作用,得到聚氨酯预聚物的扩链产物（化合物2）；在扩链产物（化合物2）的结构基础上,为了接入邻二酚粘合单元、实现材料功能修饰,同时,进一步调控目标粘合材料的分子量,经由3）偶联过程进行目标粘合材料的侧链修饰,得到了一种MAP高分子仿生粘合材料（化合物3）。

图1 MAP仿生粘合材料的合成路径Fig. 1 Synthetic route of the biomimetic MAP adhesive material

基于MAP中邻二酚结构离解吸附与氧化交联共同作用的粘合机制,进行仿生合成设计,能够初步保证目标粘合材料（化合物3）的低毒性及生物相容性；同时,进行扩链、偶联的分步合成,实现了对合成路线的分段调控,加强了粘合材料合成的可修饰性,为人工粘合材料未来研发工作中的分节点合成与功能化修饰提供了参考。

1.2.1 聚氨酯预聚物（化合物1）的合成[14]

DMF为溶剂、氮气保护下,将物质的量之比为2：1.2的IPDI与PPG 1000混合均匀,反应6h后,减压蒸馏,得到无色至浅黄色的油状物,即为聚氨酯预聚物（化合物1）。

1.2.2 聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2）的合成

DMF为溶剂、氮气保护下,将物质的量之比为1：2：0.2的聚氨酯预聚物（化合物1）、DMPA、DBTL混合均匀,反应3h,得到无色至浅黄色油状物,即为聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2）。

1.2.3 目标MAP粘合材料（化合物3）的合成

DMF为溶剂、氮气保护下,将物质的量之比为1：0.12：1:0.1：15的聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2）、DCC、多巴胺盐酸盐、三乙胺、DMF混合均匀,反应8h后,得到粗产物沉淀。进行粗产物的酸洗、透析,得到目标MAP粘合材料（化合物3）,为浅黄色油状物。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

2.1.1 IR与枝节率

以KBr压片法对所合成的MAP粘合材料进行IR测定,得到图2。无论合成条件如何改变（如图2中浅灰、灰、黑色所标注的投料比变化以及催化剂DBTL加入与否）,3400～3500 cm-1处酚羟基与1600～1700 cm-1处酰胺键的特征吸收峰均有出现,只是呈现百分透过率,即吸收峰强度的差别。

图2 MAP粘合材料的红光吸收光谱Fig. 2 IR spectra of the MAP adhesive material

对比图2中所标注的浅灰、灰、黑色3个系列的吸收谱线,可知：1）在化合物2的合成中,控制催化剂DBTL加入量及其他反应条件不变,仅调控化合物1与DMPA的投料比,即初始反应物PPG 1000（与化合物1物质的量近似相当）与DMPA的投料比分别为PPG 1000：DMPA=1：1与1：3时,得到相应为灰色（PPG 1000：DMPA=1：1）与黑色（PPG 1000：DMAP=1：3）标注的2个系列吸收谱线,其中,各官能团特征吸收峰的百分透过率呈现明显差异；2）进一步对比催化剂未加入的浅灰色系列与催化剂加入的灰色/黑色系列,也呈现类似的官能团吸收峰强度差别。综合1）与2）两方面差别,能够对目标MAP粘合材料侧链中、邻二酚粘合单元的接入量做出初步判断,同时,能够对催化剂DBTL影响聚氨酯预聚物进行扩链反应时的枝节率做出分析,还可进一步实现对枝节率与MAP材料粘合性能相关性的分析。人工粘合材料的未来研发,将可围绕着催化剂品类与性能的改变、催化剂加入量的调控等方向进行,实现对粘合性、枝节率等性能参数的进一步调控。

2.1.21H NMR

DMSO-d6做溶剂、TMS为内标,对所合成的MAP粘合材料进行1H NMR测定,得到其核磁共振氢谱,特征氢的化学位移如图3所示标注。其中,δ=8.28与～3.70分别对应于羧基与酚羟基中活泼氢的特征位移,说明MAP粘合材料的侧链结构中,已通过聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2）与多巴胺盐酸盐的扩链反应,成功接入了邻二酚粘合功能单元。

图3 催化剂DBTL加入与未加入时MAP粘合材料的核磁共振氢谱Fig. 3 1H NMR spectra of the MAP adhesive material with and without DBTL catalyst

此外,对图3中(PPG 1000-IPDI): DMPA 分别为1：1与1：3的2个系列谱线对比可知,保持测样量一致时,增加扩链剂DMPA在扩链反应中的用量,得到 (PPG 1000-IPDI)：DMPA=1：3系列的谱线强度显著增强,再结合图2中的官能团特征吸收峰强度随投料比的相应变化,能够对扩链反应中影响粘合材料枝节率的两种影响因素做出进一步判断,即催化剂DBTL与扩链剂DMPA均能显著提高目标MAP粘合材料的枝节率,从而进一步影响其粘合性能。

2.1.3 GPC与分子量分布

以聚苯乙烯为标准聚合物,流动相为含0.01 mol/L溴化锂的DMF(流速1.0 mL/min),40°C下、进行所合成MAP粘合材料的GPC测定,得到表示聚合物分子量及其分布的图4及表1。其中,由表1中接近于1的多分散指数PD=Mw/Mn可知,所合成的MAP高分子粘合材料聚合分布均匀,其黏均摩尔质量Mv=1193。

图4 MAP粘合材料的凝胶渗透色谱Fig. 4 Gel permeation chromatography of the MAP adhesive material

表1 MAP粘合材料的分子量及分布Table 1 Molecular weight and distribution of the MAP adhesive material

2.2 粘合材料稳定性与安全性评价

2.2.1 热稳定性

氮气条件下,进行所合成MAP粘合材料的热失重分析(样品用量5mg,升温速率20°C/min,温度范围40～600 °C),得到图5。

图5 MAP粘合材料的热重分析曲线Fig. 5 Thermogravimetry curve of the MAP adhesive material

由图5可见,所合成材料的热失重曲线平滑、连续,具有良好的稳定性,表现出与弹性体热稳定趋势的一些相似性[15-16]。两个热失重段分别处于1）150～250 °C与2）250～350 °C,分别对应于聚氨酯材料结构中1）因IPDI和DMPA分解而产生的软段热失重,以及2）由于PPG 1000分解所形成的硬段热失重。

2.2.2 细胞毒性

将对数生长期的EVC304细胞接种于96孔板,于37°C、5%CO2及90%湿度条件下培养24h,待细胞贴壁后更换新培养基,再加入所合成粘合材料的DMF溶液,进行目标材料的浓度梯度分组,每组浓度设6个平行孔,使各组中的粘合材料终质量浓度分别为125、250、500、1000、2000、4000 μg/L,对照组则加入等体积溶剂。于37°C恒温培养箱中,将上述加样后的96孔板培养24h,去除培养基,每孔加入配置好的20μL MTT溶液和180μL培养液,继续培养4h。移去上清液后,每孔加入150μL二甲基亚砜,震荡10min(频率60次/min),测定490nm处的吸光度数值[17-18],计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=(1-吸光度实验组/吸光度对照组)× 100%,绘制得到所合成MAP粘合材料对体外ECV304细胞的增殖抑制曲线（图6）。结果显示,所合成MAP粘合材料在ECV304细胞中的增殖抑制作用随自身浓度增加而增大,就其浓度增幅的整体趋势而言,该合成材料呈现低毒性[19]。

图6 MAP粘合材料对ECV304细胞的24h增殖抑制作用Fig. 6 Cytotoxicity of the MAP adhesive material on ECV304 at 24h

3 结论

基于MAP邻二酚结构离解吸附与氧化交联共同作用的粘合机理,经由仿生合成路径得到一种MAP型粘合材料,以热失重分析、MTT实验初步评价所合成粘合材料的热稳定性与生物安全性,同时,通过IR、1H NMR、GPC等表征该粘合材料结构。综合实验结果,合成得到的MAP型粘合材料表现良好的热稳定性与低毒性,具有进一步应用于生物医学领域、进行快速粘合修复的良好前景。

该粘合材料经由扩链、偶联的分步合成方法,实现了对合成路线的分段调控,加强了粘合材料合成的可修饰性,为人工粘合材料未来研发工作中的分节点合成与功能化修饰提供了参考。