真武汤加减联合氯沙坦钾片治疗老年早中期糖尿病肾病临床疗效及对TLR4/MyD88通路的影响

张宇 李建平 张元丽 (三亚市中医院肾病内分泌科,海南 三亚 572000)

糖尿病肾病(DN)是由于糖尿病引发的微血管病变，从而导致肾小球硬化的一种肾脏疾病〔1〕。DN是糖尿病患者最为常见的一种微血管并发症，同时也是引起患者糖尿病死亡及终末期肾病发生的重要原因〔2〕。对于早期DN患者，由于疾病发生较为隐匿，患者无典型的临床症状，因此容易被忽视，若疾病进一步发展进入晚期阶段，则不可逆〔3，4〕。因此，对于早中期DN患者而言，有效控制疾病进展是目前治疗的关键。为了进一步提高早中期DN患者的临床疗效，本研究拟分析真武汤加减联合氯沙坦钾片治疗老年早中期DN的临床疗效及对Toll样受体(TLR)4/MyD88通路的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2018年3月至2020年2月三亚市中医院收治的早中期DN且中医辨证为阳气虚血瘀证患者126例。按照随机数字表法随机分为观察组65例、对照组61例。纳入标准：①参照中华医学会糖尿病分会微血管并发症学组工作建议(2013年版)DN相关诊断标准，并参照Mogensen分期标准，属于早期(Mogensen Ⅲ期)及中期(Mogensen Ⅳ期)；②参照《中药新药临床研究指导原则》〔5〕中DN相关诊断标准，且属于中医“阳气虚血瘀”型；③患者签署知情同意书。排除标准：①合并心、肝、肾、脑及血液系统疾病者；②治疗前3 w内适应糖皮质激素、营养神经药物等患者；③治疗依从性差、耐受性差及合并药物使用禁忌证者。两组临床资料差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组临床资料比较

1.2方法 对照组给予DN常规治疗措施，给予患者饮食控制，服用降血糖药物，对于合并高血压患者给予降血压药物，给予控制感染、利尿消肿等对症治疗。此外给予患者氯沙坦钾片(扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司，H20133120，规格：100 mg)，1片/次，1次/d。观察组在对照组基础上联合给予真武汤加减治疗，组方：西洋参30 g、山药20 g、炒白术20 g、茯苓15 g、芍药15 g、炙附子12 g、泽泻10 g、红花10 g、桃仁10 g。此外，血瘀严重患者加用丹皮、赤芍；乏力明显患者加用党参；畏寒严重患者加用干姜。每天1剂，水煎服，分早晚服用。两组均连续治疗3个月。

1.3尿白蛋白排泄率(UAER)、24 h尿蛋白定量(24 h-UTP)检测 治疗前后留取患者尿液标本，嘱咐患者将早晨6时清晨第1次排尿弃去，然后留取24 h全部尿液，混匀后测量并记录总尿量，再取10 ml尿液送检。采用免疫比浊法测定UAER，采用散射免疫比浊法检测24 h-UTP。

1.4血尿素氮(BUN)及血清肌酐(Scr)检测 治疗前后抽取两组清晨空腹静脉血，常规分离血清，采用全自动生化分析仪检测患者BUN及Scr水平。

1.5外周血单个核细胞(PBMC)分离及TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表达检测 分别于治疗前后，抽取两组外周血10 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，使用Ficol液常规分离患者PBMC。使用Trizol试剂，充分混匀后置于-80℃备用提取RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度与纯度。取总RNA 20～50 μg，去除RNA基因组后按照步骤合成cDNA。采用qPCR法检测TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表达水平，使用18S rRNA作为内参基因。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表2。PCR程序参照说明书进行设定，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s，共完成40个循环。以18 S rRNA作为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。

1.6临床疗效评价标准 显效：患者临床症状基本消失，24 h-UTP较治疗前下降≥50%；有效：患者临床症状减轻，24 h-UTP较治疗前有所下降，但是不足50%；无效：患者临床症状未改善或恶化，24 h-UTP无变化甚至升高。治疗总有效率=显效率+有效率。

表2 引物序列

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件行t、χ2检验。

2 结 果

2.1两组临床疗效比较 观察组治疗显效37例(56.92%)、有效26例(40.00%)、无效2例(3.08%)，对照组显效24例(29.34%)、有效28例(45.90%)、无效9例(14.75%)，观察组治疗总有效率(96.92%)高于对照组(85.25%)，差异有统计学意义(χ2=5.385,P=0.020)。

2.2两组治疗前后UAER、24 h-UTP比较 治疗前两组UAER、24 h-UTP差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后两组显著降低(P<0.05)，且观察组显著低于对照组(P<0.05)，见表3。

2.3两组治疗前后BUN、Scr比较 治疗前两组BUN、Scr水平差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后两组显著降低，且观察组显著低于对照组(P<0.05)，见表4。

2.4两组治疗前后TLR4、MyD88及NF-κB mRNA比较 治疗前两组TLR4、MyD88及NF-κB mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后两组TLR4 mRNA显著降低，MyD88 mRNA、NF-κB mRNA显著升高(P<0.05)；且观察组TLR4 mRNA显著低于对照组，MyD88 mRNA、NF-κB mRNA显著高于对照组(P<0.05)，见表5。

表3 两组治疗前后UAER、24 h-UTP比较

表4 两组治疗前后BUN、Scr比较

表5 两组治疗前后TLR4、MyD88及NF-κB mRNA比较

3 讨 论

随着我国人口老龄化结构的不断加剧，我国糖尿病患者越来越多，而DN是糖尿病患者最为主要的并发症之一，同时DN也是导致终末期肾病的主要原因〔6〕。DN属于我国传统中医学“水肿”“消渴”“虚劳”等范畴，随着患者病情的迁延发展，不仅耗损人体之精气，同时伤及患者脏腑，从而导致机体脏腑功能的不足，引发脏器功能失调，则痰瘀湿邪内停，气血阴阳紊乱〔7，8〕。对于DN而言，由于脏腑功能失调则导致津液运化失常，病理产物瘀血、湿浊、痰饮相互滋生同时又互相影响，造成疾病进展〔9〕。同时加之糖尿病患者自身机体虚弱、饮食不节，导致脾失健运而气血不足，虚热内盛，最终导致津液受损而引发消渴症〔10〕。现代药理研究显示〔11，12〕，DN的发病机制与氧化应激、遗传易感因素、多种细胞因子表达过多、肾小球外细胞基质堆积、凝血机制异常及糖基化末端产物产生过多等多种因素有关。上述多种原因导致机体肾内微循环障碍，从而导致肾小管滤过膜通透性增加，最终引发DN〔13，14〕。真武汤是治疗水湿泛滥、脾肾阳虚的重要方剂之一〔15〕。方中附子温壮肾阳、回阳救逆；白术健脾燥湿、和中益气；芍药平肝养血、敛阴和阳；茯苓利水渗湿；西洋参益气养阴；桃源、红花活血化瘀；泽泻通利小便。以上诸药合用，温脾肾、利水湿、益中气、去瘀血，更凑温阳益气、活血化瘀之功效。本研究结果与相关研究报道结果相似〔16〕，提示真武汤甲减联合氯沙坦钾片治疗，可有效提高老年早中期DN的临床疗效，同时有效降低尿蛋白水平，提高肾小球滤过率，改善机体肾功能。肾为先天之本，正气之根，肾气决定了先天禀赋的强弱，直接关系到正气的盛衰，对调整及维持机体免疫的平衡具有重要作用〔17〕。肾阳和肾阴二者协调平衡，处于一种“阴平阳秘”的状态，从而表现为机体的康复自愈能力、自我调节能力、抗病防病能力及适应环境的能力等，这与现代医学免疫理论相一致〔18，19〕。免疫稳态的维持需要一系列免疫分子之间信息的相互传递和整合，而信号通路是实现免疫稳态维持这一重要生物学过程的途径〔20〕。TLR/MyD88信号通路是介导天然免疫反应的一种重要信号转导通路。TLRs激活后可通过依赖和非依赖MyD88信号转导途径，最终导致核因子(NF)-κB活化及炎性反应的增加〔21，22〕。本研究结果提示真武汤加减治疗可调控DN患者TLR4/MyD88通路基因表达，从而纠正患者免疫紊乱状态，这可能是DN治疗的分子机制之一。

综上，真武汤加减联合氯沙坦钾片治疗老年早中期DN临床疗效显著，可有效降低患者尿蛋白水平而改善机体肾功能，其作用机制可能与调控TLR4/MyD88通路基因表达有关。