急性髓系白血病患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平及其与临床病理特征的关系

王晓萍，李启欣，林 静

佛山市第一人民医院检验科，广东佛山 528000

急性髓系白血病(AML)为人类常见造血系统恶性肿瘤，骨髓中集聚血细胞的髓性癌，且快速生长的异常白细胞会干扰正常血细胞的生成，可致髓性癌从骨髓进入血液并取代正常血细胞所引起的高度异质性疾病，呈现慢性进展的特点，严重危害人体健康[1]。近年来，尽管移植预处理方案不断优化，抗排斥技术不断进步，临床新药不断发展，但大多数AML患者的预后仍欠佳，患者复发率较高，其根本原因在于微小残留的存在，故最大限度地清除微小残留对于延长AML患者缓解期、提高治愈率至关重要[2]。随着肿瘤免疫治疗的不断进展，国内外研究发现，细胞免疫系统的功能状态与血液肿瘤的发生、发展及预后密切相关，其中，T淋巴细胞为机体重要的免疫细胞，经抗原刺激后能形成特异性的细胞毒T淋巴细胞而产生抑制抗肿瘤免疫的作用[3-5]，但AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平及其临床意义尚未完全明确。本研究以85例AML患者和85例体检健康者为研究对象进行回顾性分析，旨在进一步探讨AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平及其与临床病理特征的关系，进而为AML的临床诊治提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性选取2019年3月至2021年3月于本院就诊的85例AML患者作为AML组，另选取85例同期体检健康者作为体检健康组。AML组：年龄25～78岁，平均(60.17±2.21)岁；男46例，女39例。体检健康组：年龄25～79岁，平均(60.25±2.36)岁；男45例，女40例。两组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。其中，AML患者根据染色体检查情况可分为高危组(染色体高危核型，25例)和非高危组(非染色体高危核型，60例)。高危组：年龄26～77岁，平均(60.08±2.17)岁；男16例，女9例。非高危组：年龄25～78岁，平均(60.21±2.26)岁；男30例，女30例。两组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：(1)AML及高危AML诊断符合《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2017年版)》[6]相关标准，并经免疫学、形态学、细胞遗传学、分子遗传学分型明确诊断者；(2)入组前未接受任何医学治疗，在本院全程接受治疗，且临床资料完整者；(3)无其他肿瘤、免疫性疾病等病史者。排除标准：(1)急性早幼粒细胞白血病者；(2)伴其他严重感染性、传染性疾病者；(3)慢性骨髓增殖性疾病史者；(4)治疗相关性AML者；(5)伴严重糖尿病、高血压等内分泌疾病及心、脾、肺、肾等器质性疾病或器官病变者。

1.3方法

1.3.1治疗方案 所有AML患者入组后均接受标准诱导方案治疗，主要包括IA方案(去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷)、DA方案(柔红霉素+阿糖胞苷)、MA方案(米托蒽醌+阿糖胞苷)、HA方案(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)，根据患者病情及自身耐受情况选择合适的方法进行治疗，并于化疗后骨髓抑制期接受输注悬浮红细胞、血小板及常规抗菌药物等对症支持治疗。

1.3.2外周血T淋巴细胞亚群检测 采集AML患者规律治疗前及体检健康者的清晨空腹静脉血3 mL，经乙二胺四乙酸抗凝处理后，取100 μL标本置于流式检测管，加入相应荧光单克隆抗体(20 μL)充分混匀，避光孵育15 min(室温)，加入红细胞裂解液(2 mL)充分混匀，避光孵育10 min(室温)，1 200×g离心5 min(4 ℃)，除去上清液，加入磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)振荡混匀，洗涤2次，然后加入PBS(500 μL)混匀，采用FACSCalibur流式细胞仪检测AML患者与体检健康者、高危组与非高危组AML患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例，并计算CD4+/CD8+，所有试剂盒、溶液及仪器均由美国Becton Dickinson公司提供。

1.4观察指标

1.4.1AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平与临床病理特征的关系 通过本院电子病历系统收集所有AML患者的基因阳性突变情况,包括FMS样酪氨酸激酶3-内部串联重复基因(FLT3-ITD)、核仁磷酸蛋白基因1(NPM1)、分型[AML非特指型(AML-NOS)、AML伴重现性遗传学异常(AML-RGA)、AML伴髓系发育异常相关改变(AML-MRC)]等，并比较不同临床病理特征下的外周血T淋巴细胞亚群表达水平，标本处理与外周血T淋巴细胞亚群检测同1.3.2。

1.4.2不同疗效组AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平检测 根据《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2017年版)》[6]可将所有AML患者分为完全缓解(CR)组(55例)和未CR组(30例)，比较两组外周血T淋巴细胞亚群表达水平，经诱导化学治疗后，于AML患者骨髓恢复期(化学治疗28 d后)采集其血液标本，标本处理与外周血T淋巴细胞亚群检测同1.3.2。

2 结 果

2.1AML组与体检健康组外周血T淋巴细胞亚群表达水平比较 AML组外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+均低于体检健康组(P<0.05)，而两组外周血CD8+T淋巴细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 AML组与体检健康组外周血T淋巴细胞亚群表达水平比较

2.2高危组与非高危组AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平比较 高危组外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+均低于非高危组(P<0.05)，而两组外周血CD8+T淋巴细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 高危组与非高危组AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平表达水平比较

2.3AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平与临床病理特征的关系 FLT3-ITD突变阳性者外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞表达水平高于FLT3-ITD突变阴性者(P<0.05)；NPM1突变阳性者外周血CD4+T淋巴细胞表达水平高于NPM1突变阴性者(P<0.05)。见表3。

表3 AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平与临床病理特征的关系

2.4不同疗效组AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平比较 CR组外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+均高于未CR组(P<0.05)，而两组外周血CD8+T淋巴细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同疗效组AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平比较

3 讨 论

AML为起源于髓系造血干细胞的恶性疾病，近年来国内AML发病率呈现逐渐升高的趋势，但其具体发病机制尚未完全阐明，大多学者认为其发生、发展可能与药物、遗传因素、化学毒物、放射、机体免疫功能异常等密切相关[7-9]，其中，机体免疫功能异常所致骨髓微环境改变对于AML的发生、发展具有重要作用这一理论得到了广泛认可。随着肿瘤免疫治疗相关研究的不断深入，越来越多的研究学者发现，在抗肿瘤免疫效应中，相较于体液免疫，细胞免疫发挥着更为重要的作用，T淋巴细胞在肿瘤免疫中发挥着中心调控作用，对血液系统恶性肿瘤的免疫异常实质及临床治疗意义重大[10-11]。本研究通过分析AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平及其与临床病理特征的关系取得了较好的研究结果。

T淋巴细胞亚群属于人胸腺中输出细胞，可执行细胞免疫功能及免疫调节功能，在机体免疫应答过程中，CD3+T淋巴细胞代表T淋巴细胞总数，其活性、数量与机体免疫应答活性、免疫活性细胞数量呈正相关；CD4+T淋巴细胞为反应细胞，可增强或扩大其他免疫细胞功能，一旦外周血CD4+T淋巴细胞减少，提示患者机体细胞免疫功能较低；CD8+T淋巴细胞则为T杀伤细胞，可对靶细胞产生细胞毒作用，同时调节性免疫抑制CD4+T淋巴细胞；CD4+/CD8+的稳定比例是维持细胞免疫反应平衡、抗肿瘤作用有效发挥的关键[12-13]。本研究结果显示，AML组外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+均低于体检健康组，高危组外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+均低于非高危组，进一步说明AML患者的机体免疫力呈抑制性优势，可见T淋巴细胞减少、功能不全及CD4+/CD8+比例失调，容易引起T淋巴细胞介导的机体细胞免疫功能缺陷，且随着病情进展，高危AML患者免疫紊乱状态更为严重。分析原因可能为：AML患者体内白血病细胞可直接抑制T淋巴细胞分化抗原的表达，还可能产生许多免疫抑制因子，如白细胞介素-2、白细胞介素-10、转化生长因子β1等，进而影响T淋巴细胞亚群分布，进一步产生促进肿瘤发生免疫逃逸、抑制机体抗肿瘤免疫的作用，形成恶性循环，严重影响AML患者治疗效果及预后[14]。黄方等[15]研究亦指出，AML患者机体存在免疫功能紊乱，可致外周血T淋巴细胞亚群表达水平下降。

本研究结果显示，FLT3-ITD突变阳性者外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞表达水平高于FLT3-ITD突变阴性者，NPM1突变阳性者外周血CD4+T淋巴细胞表达水平高于NPM1突变阴性者，与李珊等[16]研究结果相一致。分析原因可能为FLT3-ITD突变可致非配体依赖性的FLT3受体自身磷酸化，使得酪氨酸激酶受体途径异常活跃，容易引起细胞增殖、活化异常而影响免疫活性细胞的产生、增殖及分化，使得CD3+、CD4+T淋巴细胞表达水平升高；NPM1蛋白在正常生理状态下可参与脱氧核糖核酸聚合酶活性的调节、核糖体的转运、中心体的生物合成等，还可发挥肿瘤抑制作用，一旦出现NPM1突变则可能破坏正常血细胞的增殖、分化与凋亡，进一步引起机体微环境的代谢紊乱，进而影响T淋巴细胞的表达，使得外周血CD4+T淋巴细胞水平升高，具体影响机制有待进一步探讨[17-19]。本研究还发现，CR组患者外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+均高于未CR组，提示临床疗效较好的AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平可见明显升高，分析原因可能为：AML患者经标准诱导方案进行化学治疗诱导缓解后，其体内白血病细胞负荷明显下降，有助于促进T淋巴细胞亚群表达水平获得部分恢复[20-23]。

综上所述，AML患者随着病情进展，可致外周血T淋巴细胞亚群表达水平降低而引起机体免疫功能失衡；而FLT3-ITD突变阳性可致外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞表达水平升高，NPM1突变阳性可致外周血CD4+T淋巴细胞表达水平升高，且临床疗效较好的AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平可见明显升高。临床可通过密切监测AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平以对其病情进行评估，并为临床治疗方案、用药强度等提供参考。本研究亦存在一定的不足，如样本量较小、为单中心研究等，容易导致结果出现一定的偏倚，临床需进一步进行大样本量、多中心的研究以明确AML患者外周血T淋巴细胞亚群表达水平及其与临床病理特征的关系。