基于生物信息技术分析人参皂苷防治乳腺癌的作用机制

吴勤研,蓝晓红,吴 波,魏 玮,李薛梅,初晓玲,高 茗

0 引 言

乳腺癌是女性患者最常见的一种恶性肿瘤，国际的发病率在11%左右，而我国的乳腺癌发病率占女性患者的16%左右，在女性患者恶性肿瘤发病率占第一位，其发病率、致死率高，严重威胁女性健康[1-2]。乳腺癌的发病风险是随着年龄增大而升高，但随着生活环境、作息习惯的改变，生活压力聚增，乳腺癌的发病年龄逐渐呈年轻化的趋势。现阶段治疗乳腺癌的方法有手术、化疗、放疗、内分泌治疗、靶向药物治疗和抗体药物偶联剂治疗等，但伴随恶心、呕吐、骨髓抑制、心血管系统障碍和耐药性增加等诸多不良反应[3]。中药属于天然药物，相比合成药物而言，刺激性和毒副作用小，不少研究学者提出中医药充当辅助用药[4]。人参是我国古老的中药材之一，具有补气生津、扶正祛邪、补脾益肺和安神益智等功效[5-6]。现代药理研究表明人参可以增强记忆力[7],提高免疫力[8]，抗衰老[9]和抗肿瘤[10-11]等药理作用。人参皂苷是人参的主要药效成分，由糖和苷元连接而成，常见的单体皂苷有Rg1、Rb1、Rc、Re、Rd、Rf和Rg1等等。现有文献报道了单一皂苷抗肿瘤效果，尚不能反映整体效果和毒副作用。笔者依托生物信息技术，比较人参皂苷组与空白对照组，获取差异表达基因，分析基因功能与代谢通路的作用机制，阐释人参皂苷防治乳腺癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料所用平台：基因表达数据库GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白质相互作用数据库STRING(https://string-db.org/)，用于注释、可视化和集成发现的数据库DAVID 6.8(http//david-d.ncifcrf. gov/tools. jsp)；软件：生物医学数据分析盒子SangerBox(http://vip. sangerbox.com/home.html)，可视化分析软件Cytoscape 3.7(https://cytoscape.org/)，图像处理软件GraphPad Prism 8(https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片获取与差异基因的筛选在GEO数据库输入GS85871，得到关于人乳腺癌细胞MCF7的芯片信息(分析平台为GPL571)。先将样本进行分组：“Treatment”为人参皂苷(Rg1、Rb1、Rb3、Rc、Rb2、Re和Rd)干预组，“Control”为空白对照组。然后运用在线分析工具GEO2R对20个样本进行分析(其中人参皂苷干预组有14个样本，空白对照组有6个样本)，并设置筛选条件(P<0.05,∣log2FC∣≥1)[12-14]。

1.2.2 蛋白互作PPI网络分析将筛选后的差异基因导入到STRING平台，设置种族为“Homo sapiens”，最低工作阈值为0.4，其他参数默认[15]，提交。将所得结果导入Cytoscape 3.7软件，用“Network analyzer”工具对结果进行分析，按度值(Degree)进行排序，得到核心基因(筛选条件Degree≥5)。

1.2.3 基因本体(GO)和京都基因百科全书KEGG通路富集将差异基因导入DAVID 6.8平台，种族设置为“Homo sapiens”，选择标识符设置为“Offical gene symbol”，得到基因本体(GO)功能富集和KEGG信号通路富集分析数据。

2 结 果

2.1 差异基因的筛选与分析将人参皂苷干预组与空白对照组组进行比较，得到182个差异基因，其中上调有110个，下调有72个。运用SangerBox绘制火山图，见图1；利用GraphPad Prism 8软件绘制前30个上调基因或下调基因的热图，见图2。

绿色点表示下调基因，红色点表示上调基因，点距离中线越远，差异倍数越大

蓝色方块表示下调，黄色方块表示上调

2.2 基因本体(GO)功能富集分析分别将上调和下调差异表达基因导入到DAVID 6.8平台，进行GO富集分析。上调基因富集在细胞外间隙、轴突、突触后膜和质膜外侧，主要参与细胞黏附、蛋白质磷酸化的正调控、轴突导向、对缺氧的反应和胶质细胞迁移等生物过程，见表1。下调基因显著富集在胞外区、蛋白质细胞外基质、细胞外间隙、内质网腔和质膜，主要参与对 cAMP 的反应、内皮细胞迁移的正调控、血小板脱粒、细胞间信号转导、细胞黏附、细胞表面受体信号通路和血管生成的负调控等生物过程，见表2。

表1 上调基因的GO功能注释(涉及生物学过程、分子功能和细胞组成)

表2 下调基因的GO功能注释(涉及生物学过程、分子功能和细胞组成)

2.3 京都基因百科全书KEGG通路富集上调基因富集主要在甲状旁腺激素合成、分泌和作用(hsa04928)、GnRH 分泌(hsa04929)、阿米巴病(hsa05146)和多巴胺能突触(hsa04728)。下调基因富集主要在细胞因子-细胞因子受体相互作用(hsa04060)、PI3K-Akt 信号通路(hsa04151)和ECM-受体相互作用(hsa04512)等。差异表达基因富集主要在细胞因子-细胞因子受体相互作用(hsa04060)、阿米巴病(hsa05146)、弓形体病(hsa05145)、癌症中的微小RNA(hsa05206)、ECM-受体相互作用(hsa04512)、2型糖尿病(hsa04930)和疟疾(hsa05144)。见图3。

a:上调基因通路富集;b:下调基因通路富集;c:差异表达基因通路富集

2.4 差异表达基因蛋白互作PPI分析将差异表达基因导入STRING平台，设置相应参数，得到蛋白互作PPI网络，见图4，图中有169个节点(无效基因有13个)，184条边，平均节点度值为2.18，PPI富集校正值为2.56×10-8；然后将数据导入Cytoscape 3.7软件，计算拓扑网路的度值，并按度值进行排序，设置筛选条件，得到9个核心基因，分别是VEGFA,BMP4,SPARC,PLG,ITGB2,TEK,SERP,INA1,SERPINB5和IGFBP7,对核心基因进行蛋白互作PPI网络，见图5，图中有9个节点，19条边，平均度值4.22，PPI富集校正值为2.59×10-11。

图4 差异基因PPI网络图

图5 核心基因PPI网络图

3 讨 论

中医理论认为“正气存内，邪不可干”、“邪不能独伤人”，正气虚弱是肿瘤发病的主要因素，体内正气不足时出现外邪侵体，损伤人体脏腑气血，长年累月则发病，因此扶正祛邪是中医药治疗乳腺癌的关键所在[16]。现代中医运用人参、熟地、白术、茯苓以益气健脾，可通过增强淋巴细胞增殖、增强机体免疫功能，同时诱导细胞凋亡来抑制肿瘤发展。大量研究报道人参皂苷抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，被广泛运用于抗乳腺癌的辅助用药中，但其生物学作用机制尚不清楚[17-19]。生物信息技术作为现代科学技术发展的产物，融合了基因组学、蛋白质组学、免疫组学、代谢组学等多组学的数据集，利用微阵列、高通量测序工具，从基因、蛋白质序列出发，分析相关的生物信息，并通过大数据筛选出与肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因，通过对目标基因的分析，可以预测药物的作用机制及可能引起的不良反应[20-21]。笔者采用生物信息学的技术方法从GEO数据库中挖掘人参皂苷作用于乳腺癌的基因芯片(GSE85871)。通过比较人参皂苷干预组与乳腺癌细胞组(MCF3/Adr)，得到人参皂苷调控乳腺癌的差异表达基因有182个(其中上调有110个，下调有72个)。在此基础上，运用STRING平台构建差异表达基因蛋白互作PPI网络，并运用David6.8平台进行GO和KEGG通路富集分析。

PPI网络分析得到核心基因VEGFA,PLG,SPARC,BMP4,TEK,SERPINA1,SERPINB5,ITGB2和IGFBP7，其中VEGFA,PLG和SPARC在网络中的分值较高，在疾病的发生、发展过程中起着关键作用。血管内皮生长因子A(vascularendothelial growth factor A，VEGFA)属于VEGF家族成员中的一员，在调控血管生成网络中起重要着作用[22]。正常组织受到外界创伤以及女性生理月经周期，血管生成通路将会被激活，进而形成新血管[23]。肿瘤组织中VEGFA过度表达，形成新生血管量高于正常组织，影响周围正常组织细胞生理代谢[24]。纤溶酶原(plsmingen, PLG)是血浆纤维蛋白水解酶的无活性前体，属于丝氨酸蛋白酶，被组织激活物t-PA、尿激酶或凝血接触阶段多种酶激活，转变成纤溶酶溶解纤维蛋白。进一步研究发现纤溶酶能促进细胞迁移，参与了乳腺癌细胞的侵袭和转移[25-26]。富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(cysteine-rich acidic secreted protein, SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白，广泛分布在生物体内，参与组织重建、形态生成、细胞迁移和增殖，与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关[27-28]。与对照组比较，人参皂苷干预后乳腺癌细胞的VEGFA、PLG和SPARC表达降低，推测人参皂苷作用于上述靶点基因抑制乳腺癌细胞增殖、黏附、侵袭和转移。

GO生物过程涉及细胞黏附、发芽血管生成、细胞迁移与癌细胞的生长繁殖密切相关。KEGG结果发现12条信号通路，主要包括细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、阿米巴病信号通路、弓形虫病信号通路、癌症中的微小RNA信号通路和ECM-受体相互作用信号通路等，其中细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的微小RNA和ECM-受体相互作用信号通路与癌细胞的增殖、分化、转移有着密切联系。细胞因子是由免疫原或其他因子刺激细胞产生，具有调节细胞的生长和分化、调节免疫、参与炎症发生和创伤愈合等功能的小分子多肽的总称。细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。细胞因子和其受体的结合是细胞因子介导的细胞信号转导的启动刺激。大多数细胞因子对乳腺癌细胞具有抑制生长、促进凋亡的负面作用，同时具有促进生长繁殖、为侵袭转移提供条件的作用。微小RNA(又称miRNA)是一类小分子非编码RNA，在乳腺癌中可扮演癌基因或抑癌基因，在肿瘤侵袭转移级联反应各个阶段起到促进或抑制作用，与肿瘤的上皮-间质转化及肿瘤干细胞的生存高度相关[29]，miRNA作为乳腺癌早期诊断的标识物在临床上被广泛运用。细胞外基质(extracellular matrix, ECM) 是肿瘤微环境的重要组成部分，由支持细胞和组织架构的蛋白质、糖蛋白和多糖组成的复杂混合物，与特定细胞表面受体结合，激活信号转导级联反应等途径促进多种恶性肿瘤细胞的生长、增殖、转移和耐药性的形成。此外，ECM蛋白降解过程中释放调节多种细胞活性的肽类分子(统称细胞外基质活性素matrikine)，调节肿瘤细胞活性和血管生成，并参与肿瘤分化、浸润和侵袭过程。以上研究表明人参皂苷主要通过抑制肿瘤细胞增殖、转移、生长及血管形成途径来防治乳腺癌。

综上所述，人参皂苷通过对多个基因、多个靶点和多条信号通路来抑制乳腺癌细胞增殖、分化和侵袭。本文选取的人参皂苷单体成分较为局限，不能完全反映人参抗癌物质成分。此外，现有文献报道人参多糖对癌细胞的增殖有显著的抑制作用。因而，抗癌活性成分筛选及相关机制仍需深入研究。