74个观赏海棠品种的遗传多样性及指纹图谱构建

董聚苗， 刘 月， 李扬森， 冯树香， 程蓓蓓， 刘振林， 张国君

(1.河北科技师范学院园艺科技学院/河北省特色园艺种质挖掘与创新利用重点实验室， 河北 昌黎 066000；2.唐山市丰南区农业技术高级中学， 河北 唐山 063306； 3.永清县农业农村局， 河北 永清 065699；4.河北省林业和草原科学研究院/河北省森林城市建设技术创新中心， 石家庄 050061)

观赏海棠为蔷薇科(Rosaceae)苹果属(MalusMill.)人工选择培育的一系列品种的总称[1]。我国海棠资源丰富，是苹果属植物种数最多、特有种最多的区域，也是世界苹果属分布中心及多样性中心[2]，海棠花、果、叶变异丰富，具有很高的观赏价值。目前我国对海棠种质资源缺乏全面系统的调查、收集、保存和分类。观赏海棠品种间差异不明显，采用传统的表型鉴定难度大[3]，因此高效准确地鉴定品种对观赏海棠新品种的选育、推广具有重要的意义。

DNA指纹图谱技术是随着分子生物学发展而建立起来的应用性的遗传种质分析方法，以SSR技术为基础的方法比较稳定有效，是首选的标记技术[4]，目前常用于苹果属遗传多样性分析和分子鉴定[5-7]。本研究选取国内外常见的74个观赏海棠品种(其中包括6个苹果栽培品种)为材料，采用SSR分子标记技术对其遗传多样性及其亲缘关系进行研究，构建指纹图谱，以期为海棠种质资源的保护、利用、鉴定提供参考和依据，为育种亲本的选配提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为河北科技师范学院海棠资源圃中的观赏海棠68个种(品种)和6个苹果栽培品种(编号：63～68)，共74个种(品种)[8-9]。

1.2 试验方法

1.2.1花朵、叶片、果实的调查与测量

按照国际植物新品种保护联盟(UPOV)[10]的新品种特异性、一致性和稳定性(DUS)对观赏海棠品种的叶花果表型性状进行描述[9]。

1.2.2DNA提取

参考吴瑞姣等[11]的改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法，提取观赏海棠幼叶的DNA[8]。

1.2.3SSR-PCR体系及扩增条件

试验中的SSR引物是参照国内外对苹果属植物的研究[12]中挑选出的，所用20对引物和SSR-PCR扩增条件详见参考文献[8]。

1.2.4数据处理与分析

用Powermarker 3.25软件分析引物和观赏海棠种质资源的遗传多样性参数[8]，用SPSS 17.0软件对表型性状进行分析[9,13]，并用FigTree软件对观赏海棠不同的品种进行聚类分析[13]。

2 结果分析

2.1 表型遗传多样性

2.1.1观赏海棠品种性状测量

不同海棠品种间花径、果实大小、花瓣数均存在显著差异(表1)。单果重的变异系数最大，达125.2%。单果重最小为0.28 g(萨金特·蒂娜)和最大为20.52 g(白兰地)。变异系数最小的为果形指数(9.78%)，说明在果形方面遗传较稳定。74个海棠品种的平均花径为40.19 mm，变异系数为16.5%。花径最小为24.77 mm和最大为57.43 mm。花瓣数大多为5个，仅10余个品种花朵为重瓣或半重瓣。

2.1.2观赏海棠品种表型性状

不同海棠品种的叶花果颜色丰富(表2)。叶片大部分为绿色和变色叶(新叶为紫色，成叶为绿色)，仅有4.11%的品种为常紫色叶(如皇家雨点、王族和完美紫叶)。花色有白色(47.14%)、紫粉色、紫红色(34.29%)等。果色有红色(33.8%)、黄色(26.77%)、橙红色和深红色等。

表2 观赏海棠品种叶、花、果颜色性状Table 2 Traits of leaf,flower and fruit of ornamental crabapple varities

2.1.3观赏海棠不同品种花期与果期

74个海棠品种开花始期从4月10日(粉芽)到4月25日(科里)，花期持续天数从8 d(罗宾逊)到17 d(粉芽)不等(图1)，花期持续时间多为10～14 d(图1)。74个海棠品种从开花始期4月10日至落花终期5月6日，在近一个月的时间内均有花可赏。观赏海棠品种观果期多集中在9月至11月(图2)，有极少数几个品种8月底之前果实就会脱落(队长、道格)，也有几个品种的果实可以宿存到翌年3月，观赏期可达5个月以上(唐纳德·怀曼、红宝石、糖美林)。

图1 观赏海棠不同品种开花时期多样性 Fig.1 Diversity of flowering period for ornamental crabapple varieties

图2 观赏海棠不同品种果实观赏期多样性Fig.2 Diversity of fruit at ornamental period for ornamental crabapple varieties

2.2 分子遗传多样性

2.2.1SSR标记扩增结果

利用20对引物对74个海棠品种进行PCR扩增，共检测到766个等位基因，扩增出的多态位点百分率达100%，每个位点的平均等位基因数为38.3个(表3)；杂合度变化幅度为0.43～0.81；遗传多样性信息含量平均值为0.94，幅度为0.86～0.97；基因多样性指数平均值为0.94。

表3 20对引物对74个品种的扩增结果Table 3 PCR of 20 pairs of primers for 74 ornamental crabapple varieties

2.2.2聚类分析

基于遗传距离可将74份海棠种质资源分为四大类群(图3)。第一类群共8个品种，第二类群为我国传统海棠品种重瓣粉海棠，第三类群为凯尔斯海棠和队长海棠，其余为第四类群，包括苹果栽培品种、湖北海棠、西蜀海棠等。

图3 基于SSR标记的观赏海棠品种的聚类Fig.3 Cluster of ornamental crabapple varieties based on SSR markers

2.3 指纹图谱构建

以1和0分别代表某个等位基因位点扩增DNA条带的有无，将SSR图谱转换为由1和0组成的字符串，即构成数字指纹[14]。利用3对引物成功构建了包含74份观赏海棠种质的DNA指纹图谱库(表4)。第一对引物(28 f 4)可以区分17个品种，增加第二对引物(CH 04 f 10)时可以区分67个品种，增加第三对引物(GD 142)时可以完全区分74个观赏海棠品种。

表4 74个观赏海棠品种的指纹图谱Table 4 Fingerprints of 74 ornamental crabapple varieties

表4(续)

3 结论与讨论

74个观赏海棠品种的表型丰富多样，叶色多为绿色和变色，仅有4.11%的品种为常紫色。花色有白色、紫粉色、紫红色等，果色有红色、黄色、橙红色和深红色等。开花始期最早的4月10日，最晚的4月25日，花期多为10～14 d。不同品种间花径、花瓣数均存在显著差异。在果实形态方面变异系数最小的为果形指数(9.78%)，变异系数最大的为单果重(125.2%)。

基于SSR标记欧氏距离，74个观赏海棠品种聚为四大类。第一类包含科里海棠、萨式海棠等8个品种，其中6个品种为北美海棠。第二类群为我国传统海棠品种重瓣粉海棠。第三类群为凯尔斯海棠、队长海棠两个品种，它们均为重瓣花，果实脱落较早。第四类包含63个品种，包括苹果栽培品种、湖北海棠、西蜀海棠等。冬季观果优良资源红宝石海棠、唐纳德·怀曼海棠、糖美林海棠均属于第四类群。众多学者在表型形态的基础上利用SSR对苹果属和湖北海棠等种质资源的亲缘关系和遗传多样性进行了分析[15]。观赏海棠品种的遗传多样性及其亲缘关系分析，可以为育种亲本的选配提供依据。

SSR分子标记还可以用来进行分子鉴定和构建指纹图谱[15]。本研究筛选出20对SSR核心引物，建立了基于SSR分子标记的观赏海棠品种分子标记筛选鉴定体系，最终利用3对引物成功构建了包含74份观赏海棠种质的DNA指纹图谱，可为观赏海棠新品种的分子鉴定提供参考。