miR-188-5p对胰岛素抵抗Hep G2细胞的改善作用研究

徐金娥，张 征

(1.湖北省天门市第一人民医院内分泌科，湖北 天门 431700；2.湖北省安陆市普爱医院普外科，湖北 安陆 432600)

2型糖尿病是一种常见的代谢紊乱疾病，是世界范围内死亡的主要原因之一[1]。肝脏是胰岛素主要的靶点之一，通过平衡肝脏葡萄糖的输出和储存，维持机体内的葡萄糖稳态[2]。胰岛素抵抗为2型糖尿病的重要特性之一，肝脏葡萄糖代谢紊乱可导致肝脏胰岛素抵抗，最终引发2型糖尿病[3]。胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2，IGF2BP2)的主要功能是调节细胞代谢[4]，其基因表达水平与胰岛素抵抗值呈正相关[5]。通过TargetScan Human 7.2网站预测，可显示IGF2BP2为miR-188-5p的靶向基因，Ding等[6]研究亦证实了miR-188与IGF2BP2之间的靶向关系。因此推测过表达miR-188-5p可能对胰岛素抵抗发挥作用。胰岛素反应性葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter type 4 protein，GLUT4)对机体葡萄糖代谢发挥关键性作用，调控GLUT4表达为代谢性疾病的治疗提供全新的方向[7]。但关于miR-188-5p对GLUT4表达的影响以及在胰岛素抵抗中的作用鲜有报道。本研究通过高糖诱导人肝癌细胞Hep G2胰岛素抵抗模型，干预细胞中miR-188-5p的表达水平，观察细胞对葡萄糖摄取以及GLUT4表达的影响，阐述miR-188-5p在Hep G2细胞胰岛素抵抗的作用，以期为2型糖尿病的治疗提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂与仪器 人肝癌细胞Hep G2源自中国科学院上海细胞库。DMEM购自美国Hyclone公司，胎牛血清、Opti-MEM购自美国Gibco公司，D-(+)-葡萄糖购自美国Sigma公司，反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司，SYBR Green PCR试剂盒购自美国KAPA Biosystems公司，CCK8溶液、糖原含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，葡萄糖测试盒购自南京建成生物工程研究所，小鼠抗人GLUT4抗体购自英国Abcam公司，Lipofectamine RNAiMAX购自美国Invitrogen公司，miR-188-5p mimic、inhibitor及其对应的NC由广州锐博生物科技有限公司合成。倒置显微镜(德国莱卡公司，型号：DMIL LED)，荧光定量PCR仪(美国Bio Rad公司，型号：CFX-Connect 96)，凝胶成像系统(北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY045-3C)，酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司，型号：AMR-100)，激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司，型号：C2)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将人肝癌细胞Hep G2从液氮罐中取出，于37 ℃水浴至冻存液完全融化。将细胞悬液转移至新离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃上清，加入1 mL DMEM重悬细胞沉淀。转移至培养瓶中，再加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

1.2.2胰岛素抵抗细胞模型构建 待细胞融合度达到70%～80%后，将细胞分为对照组和模型组，对照组采用含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基孵育24 h，而模型组细胞则采用含高浓度(30 mmol/L)葡萄糖的培养基孵育24 h。检测细胞中葡萄糖含量对胰岛素抵抗细胞模型进行鉴定。

1.2.3实验分组及处理 收集对数生长期的Hep G2细胞，将其分为6组：①对照组：含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养48 h；②模型组：含30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h[8]，含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h；③miR-188-5p mimic组：含30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h，miR-188-5p mimic转染细胞，含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养继续24 h；④mimic-NC组：含30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h，miR-188-5p mimi-NC转染细胞，含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养继续24 h；⑤miR-188-5p inhibitor组：含30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h，miR-188-5p inhibitor转染细胞，含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养继续24 h；⑥inhibitor-NC组：含30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h，miR-188-5p inhibitor NC转染细胞，含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养继续24 h。

1.2.4细胞瞬时转染 转染前48 h，将2×105个细胞接种于6孔板中，于培养箱中培养24 h，然后采用含30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h。取1 μL mimic或inhibitor稀释于50 μL Opti-MEM中，混匀。取3 μL Lipofectamine RNAiMAX稀释于50 μL Opti-MEM中，混匀。将2种稀释液混合，轻轻摇匀，室温孵育5 min。将混合液滴加于细胞板中，轻轻混匀，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h。

1.2.5qPCR检测miR-188-5p表达水平 TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA，再使用SYBR Green PCR试剂盒进行qPCR检测，以U6为内参基因，计算各组细胞中miR-188-5p相对表达量。qPCR反应程序：95 ℃，3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39个循环；65℃，5 s。引物序列：miR-188-5p上游引物：5′-GGGCATCCCTTGCATG-3′，miR-188-5p下游引物：5′-AGAAGCCCHCTACCTG-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.6CCK8法检测细胞增殖活力 按照不同分组处理细胞，继续培养24 h。取出细胞板，每孔加入10 μL CCK8溶液，继续培养4 h。于酶标仪中检测各孔在450 nm处的吸光值，根据所测吸光值计算各组细胞增殖率。

1.2.7生化实验检测细胞内葡萄糖及糖原含量 收集各组细胞制备细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清。PBS清洗2次，1 000 r/min离心10 min，弃上清。根据试剂盒说明书操作，处理细胞收集待测液，加样进行检测。于酶标仪中分别检测505 nm和620 nm处的吸光度，计算各组细胞内葡萄糖及糖原含量。

1.2.8免疫荧光染色观察细胞中GLUT4蛋白的表达水平 在细胞孔板中加入大小合适的玻片，再将各组细胞制成单细胞悬液接种于对应的孔板中，培养过夜。PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗3次。加入0.5% Triton X-100室温通透20 min，再封闭1 h。将玻片取出置于湿盒中，加入一抗(CLUT4，1∶200)，室温孵育1 h。PBS清洗3次，加入二抗，室温孵育1 h。PBS清洗5次，滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片液作用10 min。细胞面朝下，贴在载玻片上，于显微镜中观察细胞内GLUT4蛋白表达情况。

1.3统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件数据分析。计量资料比较采用独立样本t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1胰岛素抵抗细胞模型鉴定 与对照组比较，高糖诱导的胰岛素抵抗模型组细胞中葡萄糖含量降低，差异有统计学意义[(0.93±0.03)mmol/Lvs.(0.46±0.04)mmol/L，t=25.145，P<0.001)]，符合胰岛素抵抗模型对葡萄糖摄取率降低的特征。

2.2各组miR-188-5p表达水平及细胞增殖率比较 与对照组比较，模型组细胞miR-188-5p表达水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，miR-188-5p mimic组细胞中miR-188-5p表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，miR-188-5p inhibitor组细胞中miR-188-5p表达水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，mimic-NC组和inhibitor-NC组细胞中miR-188-5p表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，胰岛素抵抗模型组细胞增殖率降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，miR-188-5p mimic组细胞增殖率上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，miR-188-5p inhibitor组细胞增殖率下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，mimic-NC组和inhibitor-NC组细胞增殖率无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组细胞中miR-188-5p表达、增殖率比较Table 1 Comparison of miR-188-5p experssion and proliferation rate in each group

2.3miR-188-5p提高胰岛素抵抗细胞内葡萄糖及糖原含量 与对照组比较，模型组细胞内葡萄糖及糖原含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，miR-188-5p mimic组细胞内葡萄糖及糖原含量上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，miR-188-5p inhibitor组细胞内葡萄糖及糖原含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，mimic-NC组和inhibitor-NC组细胞内葡萄糖及糖原含量无明显变化，差异有统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组细胞中葡萄糖及糖原水平比较Table 2 Comparison of glucose and glycogen levels in each group

2.4miR-188-5p促进胰岛素抵抗细胞中GLUT4蛋白的表达 与对照组相比，模型组细胞中GLUT4蛋白表达减少；与模型组比较，miR-188-5p mimic组细胞中GLUT4蛋白表达上升，而miR-188-5p inhibitor组细胞中GLUT4蛋白表达下降，mimic-NC组和inhibitor-NC组细胞中GLUT4蛋白表达无明显变化。见图1。

图1 免疫荧光染色观察Hep G2细胞中GLUT4蛋白的表达蓝色为细胞核，红色为GLUT4蛋白Figure 1 Expression of GLUT4 protein in Hep G2 cells by immunofluorescence

3 讨 论

胰岛素抵抗指胰岛素作用的组织和器官对胰岛素的敏感性降低，导致胰岛素促进的葡萄糖摄取和利用的效率降低，胰岛素抵抗受到多种因素的影响[9]。胰岛素抵抗与2型糖尿病明显相关[10]，是2型糖尿病的病理生理前兆[11]。因此，对胰岛素抵抗的抑制，可能是治疗2型糖尿病的主要方向之一。

miRNA是一类表观遗传的转录后调控因子，参与了多种细胞过程的调控，在2型糖尿病的胰岛素抵抗病理过程中也发挥重要作用[12]。Paschen等[13]研究显示，miR-138-5p在胰岛素抵抗Hep G2细胞中表达增加，而沉默miR-138-5p可增加细胞内葡萄糖的摄取与糖原合成，有效抑制细胞的胰岛素抵抗。Wu等[14]研究结果显示，沉默miR-29a可改善胰岛素诱导的葡萄糖摄取，增加GLUT4向质膜的转运，因此，抑制miR-29a可能是治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病的一种新策略。miR-188-5p在肿瘤中的相关研究甚多[15-16]，在胰岛素抵抗和2型糖尿病中的研究却并不多见，但相关研究显示miR-188-5p与胰岛素抵抗相关蛋白的表达有密切联系[6]。本研究结果显示，上调胰岛素抵抗Hep G2细胞中miR-188-5p的表达，可明显促进细胞增殖，改善细胞中葡萄糖摄取以及糖原合成，而沉默miR-188-5p则导致胰岛素抵抗现象加剧，提示miR-188-5p可能具有缓解胰岛素抵抗现象的潜在价值。

GLUT4是细胞摄取葡萄糖的必需物质，在机体葡萄糖代谢中起着重要作用[17]。胰岛素抵抗的发生以GLUT4介导的葡萄糖摄取障碍为主要特征之一，当小鼠表现出胰岛素抵抗时，胰岛素敏感的外周组织中GLUT4的表达以及细胞膜上的GLUT4均减少[18]。本研究通过免疫荧光染色观察胰岛素抵抗Hep G2细胞中GLUT4表达情况，显示miR-188-5p过表达可提高GLUT4在胰岛素抵抗Hep G2细胞中的表达，沉默miR-188-5p则进一步降低胰岛素抵抗细胞中GLUT4的表达。而有关研究显示，胰岛素信号通路的改善伴随着GLUT4蛋白表达的增加，进而缓解胰岛素抵抗[19]。因此，miR-188-5p mimic干预后胰岛素抵抗Hep G2细胞中GLUT4表达增多现象进一步证实了miR-188-5p对胰岛素抵抗具有缓解作用。

综上所述，过表达miR-188-5p可明显促进胰岛素抵抗Hep G2细胞内葡萄糖的摄取，糖原的合成以及GLUT4的表达，提示miR-188-5p对胰岛素抵抗具有一定的改善作用，但其具体的作用机制还需进一步探讨。