淹水底泥反硝化消纳面源氮潜力的影响因子分析

史祯琦，房 凯，周佳华，张文娟，佘冬立

（1.河海大学农业科学与工程学院，南京 210098；2.江苏省宿迁市节约用水管理服务中心，江苏 宿迁 223800；3.江苏省水文水资源勘测局连云港分局，江苏连云港 222004）

0 引 言

反硝化作用是活化氮循环的最后一步，其基本过程是：NO3-→NO2-→NO →N2O →N2［1］。微生物主导的反硝化作用能够将生态系统固定的氮和人为活性氮以N2的形态返回到大气氮库中，因而反硝化过程是湿地生态系统氮素消纳的主要途径之一。反硝化过程影响因素众多，目前关于温度、pH、Eh、有机碳与活化氮有效性等环境因素的影响已开展较为丰富的研究［2，3］，而对于水土界面生物变化影响下反硝化规律及其机制研究还有待深入。淹水土壤生态系统水土界面普遍生长有一层周丛生物，其系统内各种生物和非生物物质交织在一起，具有很强的生态稳定性，是反硝化发生的热点区域［4］。周丛生物因素在反硝化过程中扮演双重角色，一方面在新陈代谢过程中直接主导反硝化过程，另外一方面自身对周边环境的作用反过来又影响其活性［5］。因此，分析反硝化过程影响因素时，不仅要考虑环境因子，还要综合考虑水土界面周丛生物因子的影响及其共线性关系，探究反硝化过程主控因子［6］。

由于模型结构简单、变量间关系易于说明等特点，多元线性回归模型被广泛运用于生态系统过程影响因子的分析。淹水底泥生态系统各组成部分相互影响、相互作用，导致量化后的环境因子之间不可避免的存在共线性，导致多元回归模型稳定性不强。伍德与阿巴诺［7］在1983年提出的偏最小二乘回归分析方法（Partial Least Square Regression）PLSR 模型兼具主成分分析、典型相关分析和一般最小二乘多元回归分析等多种传统多元统计方法的特点，可提取出对因变量解释性最强的自变量，预测精度较高，结果更为可靠且整体性较强，能较好的解决环境因子、生物因子之间的共线性问题。因此，本研究通过培养实验测定上覆水-周丛生物-底泥界面反硝化特征，运用PLSR 模型分析反硝化消纳面源氮潜力的影响因子，提取出主控因子，为面源污染防控提供一定理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试土壤与实验设计

培养实验在河海大学江宁校区节水园区（N31°86′，E118°60′，海拔144 m）进行。供试的底泥pH（H2O）为7.6，砂粒（0.02～2 mm）、粉粒（0.002～0.02 mm）、黏粒（0～0.002 mm）的体积分数分别为31.5%、39.6%、28.9%，有机质含量为5.8 g/kg，总氮含量为9.3 mg/kg，总磷含量为79 mg/kg，总钾含量为201 g/kg。

为研究淹水底泥反硝化消纳面源氮潜力的影响因素，对供试底泥进行覆水培养。将供试底泥风干研磨过4 mm 筛网，去除石块和大颗粒土块，并将其充分搅拌，以获得均匀的底泥样品。将底泥样品均分为56 个子样品，以1.3 g/cm3的容重，30 cm的深度，填入直径20 cm、深度40 cm 的培养盆中，加水覆盖，水层深度5 cm，整个试验周期中保持水层深度不变，每一培养盆随机添加N 营养液（按照0、50、100、200、400、600、900 和1 300 kg/hm2尿素梯度添加，各N 营养液处理设置7 次重复随机摆设）。在温室中（25 ℃）培养60 d 后，水土界面持续生长形成一层明显的周丛生物，其生物群落结构稳定，且由于水土界面N营养水平的差异，周丛生物膜生物量梯度差异明显。

1.2 反硝化速率与环境因子测定

影响反硝化速率的因素主要从上覆水、周丛生物和底泥3部分考虑。试验培养60 d 后，采用无扰动沉积物采样器（有机树脂玻璃管，内径8 cm，外径9 cm，高30 cm）采取各个处理上覆水5 cm、土层30 cm的土柱，柱底用黑色橡胶塞密封。将柱样带回实验室后，沿玻璃棒缓慢加入与上覆水氮素含量一致的硝酸钾溶液直至柱体内充满液体，拧好盖子，调整直至柱体中没有任何气泡。垂直放置于模拟原位淹水环境的培养装置中，液面高出柱子约4～5 cm，然后连接进水管和出水管。采用膜进样质谱法［8］测定柱样反硝化速率，具体方法示意见图1。

图1 膜进样质谱法测定反硝化速率示意图Fig.1 Schematic diagram of measuring of denitrification rates by Membrane Inlet Mass Spectrometry

反硝化测定后，采用便携式多参数测试仪（Hach Company，Loveland）测定上覆水中pH、溶解氧（DO）；将水样过滤后采用流动分析仪（Skalar Analytical，Breda，The Netherlands）测定上覆水体氨态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）含量；采用液态碳氮元素分析仪（Vario Toc）测定可溶性有机碳（DOC）和总氮（TN（W））。将上覆水缓慢倾倒，收集水土界面周丛生物，测定参数包括群落结构比例、叶绿素（CHI）含量。利用消毒后的薄刀片将一定面积（3×3 cm 大小，约2 mm 厚）的周丛生物从载体表面剥离，放置于烘箱105 度烘干至恒重即为生物量（BIO）［9］。通过测序分析发现在前10 种优势物种中，假单胞菌（Pseudomonas）与反硝化速率成显著相关关系，因此将其纳入上覆水影响因子中。轻轻刮取0.5 g 周丛生物膜样品，采用FastDNA®SPIN Kit For Soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）试剂盒提取土壤微生物总DNA，并采用高通量测序仪Miseq对其进行测序，使用16sr DNA进行高通量测序分析，测定底泥土壤反硝化细菌基因丰度（NIRK、NOSZ）、氨氧化古菌（AOA）、氨氧化细菌（AOB）；取底泥土样20 g，用2 mol/L KCl 溶液浸提后，采用流动分析仪（Skalar Analytical，Breda，The Netherlands）测定氨态氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3

--N）。将土样风干后研磨，过100 目筛网，使用CNS 元素分析仪（型号Vario MAX）测定全氮［TN（S）］。

1.3 数据处理

在构建PLSR 模型之前，运用SPSS statistics 25.0 进行Zscore 数据标准化、皮尔逊相关性分析，满足模型的建立要求。在偏最小二乘回归运算过程中，将交叉验证作为确定PLSR 组分的标准，进行如下计算。

式中：Q2为每一成分可解释的因变量方差比；Q2cum为偏最小二乘回归中所有成分可解释的因变量方差比；PRESS为预测误差平方和；SS为剩余平方和；a为偏最小二乘回归成分数量。

运用均方根误差（Root Mean of Squared Error，RMSE）来对模型进行校正。PLSR 模型的建立和计算均在SIMCA 14.1 软件中进行，将整理好的数据导入SIMCA 中，设定反硝化速率为因变量，环境影响因子为自变量。应用Autofit 对模型进行自动拟合，拟合过程中软件会自动进行交叉验证，使最佳解释能力（R2）与模型预测能力（Q2）相平衡。偏最小二乘回归建模过程中使用变量投影重要性指标（VIP）表示自变量对因变量预测的重要程度。回归系数（RCs）是反映偏最小二乘回归模型中自变量对因变量影响的方向和程度。

2 结果与分析

2.1 反硝化速率与环境因子变异特征

淹水底泥添加N 营养液且经过60 d 培养后，水土界面环境与生物因子均发生了显著变化（p＜0.05）（表1）。上覆水和底泥中氮含量（NO3--N、NH4+-N 和总氮TN）随添加N 营养液梯度呈显著递增趋势（p＜0.05），且各氮含量因子均呈中等变异强度。在N 营养激化作用下，底泥中参与氮素循环过程的微生物群落同样发生显著变化，底泥反硝化细菌（NIRK 亚硝酸盐还原酶基因和NOSZ 氧化亚氮还原酶基因）变化范围分别为0.53～47.63×105copies/ug 和2.58～389.33×105copies/μg，氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）变化范围分别为0.03～1.05×105copies/μg和0.47～10.48×105copies/μg。与此同时，淹水底泥在经过60 d培养后，水土界面生长有一层稳定的生物聚集体，即周丛生物，其系统内各种生物，如微生物（包括细菌和真菌）和小型动植物等生物群与非生物物质（如铁锰氧化物等）交织形成自然的一层生物膜。通过对周丛生物生物量（BIO）、假单胞菌（PSE）和叶绿素（CHI）含量的分析表明，周丛生物的生长受水土界面氮营养状况影响显著，随初始添加氮营养浓度增大，周丛生物各指标均显著增大。

表1 反硝化速率和环境影响因子数据特征Tab.1 Statistical summary of denitrification loss and associated factors

淹水底泥氮素营养状况及周丛生物的变化显著影响土柱水土界面的反硝化速率（p＜0.05）。反硝化速率的变化范围为93.1～380.42 μmol/（m2·h），平均值为185.26 μmol/（m2·h），属于中等变异强度。相关分析结果表明，反硝化速率与氮营养梯度和周丛生物各指标均呈显著正相关关系（p＜0.05）。不同于对传统“上覆水-沉积物”两相界面脱氮过程的认识，本研究也进一步表明，水土界面的周丛生物也是淹水底泥反硝化发生的热点区域。

2.2 反硝化速率变异PLSR模型构建

根据培养试验结果，构建了反硝化速率与水土界面各环境因子间的PLSR 模型（表2）。模型提取了2 个偏最小二乘回归成分，第一成分解释反硝化速率75.86%变异，第二成分解释10.97%变异，模型累计变异性解释度为86.83%，表明该模型能够反映反硝化速率变异整体信息，Qcum2＞0.5，模型能较好的对数据集进行模拟和预测。PLSR 权重图展示了反硝化速率和环境影响因子之间的关系，权重越大的因子与反硝化速率相关度越高（图2）。将2 个主成分权重综合分析，得出各因子对反硝化过程的影响作用。上覆水中pH、DOC、NO3--N 和NH4+-N 对反硝化过程起促进作用且与反硝化速率相关度较高，DO 则抑制反硝化过程；周丛生物各指标均在第一主成分系统中表现出对反硝化速率的促进作用，而底泥中NIRK、NO3--N 和TN（S）在两个主成分系统中均表现出对反硝化速率显著正向贡献作用。

图2 反硝化速率PLSR模型第一、第二主成分权重图Fig.2 Weight plots of the first and second PLSR components for denitrification rate

表2 反硝化速率变异的PLSR模型Tab.2 PLSR model of Denitrification Loss

2.3 反硝化速率的影响因子分析

在PLSR 模型中，VIP值表示自变量对因变量预测的重要程度（图3）。根据VIP值将各变量分为高影响因子（VIP值＞1）、中影响因子（0.8＜VIP值＜1）和低影响因子（VIP值＜0.8）。“上覆水-周丛生物-沉积物”三相界面中，各界面影响反硝化速率的主要因素不同。上覆水中，高影响因子主要有酸碱度（pH，VIP=1.531，回归系数=0.261）、氨根离子浓度（NH4+-N，VIP=1.378，回归系数=0.212）、硝酸根离子浓度（NO3--N，VIP=1.146，回归系数=0.135）和溶解性有机碳（DOC，VIP=1.014，回归系数=0.124），上覆水中高影响因子皆对反硝化过程起促进作用；周丛生物中影响反硝化速率的高影响因子为叶绿素含量（CHI，VIP=1.219，回归系数=-0.014）；底泥沉积物中各环境因子VIP值均＜1，其中5个因子属于中等影响因子，包括底泥氨态氮（NH4-N，VIP=0.989，回归系数=0.026）、全氮［TN（S），VIP=0.951，回归系数=0.036］、硝态氮（NO3-N，VIP=0.949，回归系数=0.085）、反硝化细菌（亚硝酸盐还原酶基因）（NIRK，VIP=0.91，回归系数=0.197）、氨氧化细菌（AOB，VIP=0.9，回归系数=-0.019）和氧化亚古菌（AOA，VIP=0.809，回归系数=0.085），底泥中各影响因子对反硝化过程主要为正向影响。

图3 反硝化速率PLSR模型中各因子VIP及RCs图Fig.3 Variable importance for the projection and regression coefficient of each predictor of PLSR for denitrification rate

3 讨 论

上覆水中，pH、DOC、NO3--N 和NH4+-N 浓度对反硝化过程有正向影响，DO 对反硝化有负向影响。DO 的平均值为7.99 mg/L（变异系数24%），属于富氧环境，而反硝化细菌是化能异养兼性菌，当水环境中DO＞6.4 mg/L 时，会使得分子氧直接供氧［10］，从而导致反硝化速率降低；Cho 等［11］发现在淹水土壤中，当O2消耗完全后，才会产生N2O。Fillery 等［12］发现当pH 上升时，N2O 还原酶活性降低，而Aamer 等［13］则认为当pH＞6.6 时，对N2O 还原酶的影响会减弱；陈曦等［2］研究认为当pH 在7.80 左右时，厌氧氨氧化速率最高；本研究培养实验pH 变化幅度较小（均值为8），进一步验证了当pH 趋于稳定后（大于6.6），对N2O还原酶的抑制减弱促进了反硝化作用［14］。绝大多数反硝化细菌是化能异养型，Lescure等［15］发现单糖对反硝化细菌的刺激更强，DOC 则为反硝化细菌同时提供了电子受体及能量来源，而易分解的DOC又刺激了土壤微生物呼吸作用，加速了厌氧环境的形成。因此，DOC 从提供能量和创造厌氧环境两个方面促进反硝化速率［16］。NO3--N和NH4+-N直接参与反硝化过程，NO3--N浓度的提高激发了微生物活性，加速底泥土壤的反硝化进程，验证了佘冬立等［6］研究结果，同时二者作为反应物和氧源影响着化学反应方向及微生物的呼吸作用［17］。底泥沉积物中，NO3--N 对反硝化过程有较大的正向影响。NO3--N 作为反应电子受体及反应产物，直接影响土壤反硝化速率；而在pH 值较高的环境中，NO3--N 含量过高则会抑制N2O 还原酶（此抑制作用可逆）［18］，提高反硝化气体产物的N2O/N2的比率。底泥NIRK、AOA、AOB 属于中影响因子，其中NIRK 对反硝化速率具有显著的正向作用。

相对于单一微生物群落，周从生物具有多种特殊的“集体功能”，如具有多种酶促协同作用，周丛生物含有多种酶蛋白如碱性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶等［19］，这些酶活性能直接或间接影响反硝化速率。周丛生物中CHI 为影响反硝化速率的主要因子。CHI 是衡量藻类数量的指标，日间藻类的光合作用造成水体富氧以及pH 的升高，夜间藻类自身及其他微生物的呼吸作用又会降低DO，DO 的具体数值实际上是生态系统中藻类光合作用与其他微生物生命活动耗氧平衡的结果。其生长过程中产生的胞外多糖［20］为反硝化细菌提供了好氧—缺氧界层，在它大量凋亡分解的过程中又需要较多的氧气甚至会形成缺氧环境［21］，同时还会提高DOC 和氨氮浓度［22］，促进反硝化反应。此外，Thind 和Rowell 的研究表明［3］，藻类所吸收的氮素的40%会在体内迅速矿化，最后释放到环境中刺激作物生长，这意味着藻类保护了部分氮素阻止其参与反硝化过程。同时，周丛生物可以通过影响上覆水和底泥环境因子而导致反硝化速率发生变化。例如，周丛生物光合作用释放大量氧气［4］，提高上覆水和表层沉积物氧化还原电位，从而有利于硝化反应；硝态氮扩散到毗邻的厌氧层，在反硝化细菌的作用下转化成氮气［23］，最终损失到大气中。

4 结 论

（1）淹水底泥水土界面氮素营养状况及周丛生物的变化显著影响沉积物反硝化速率（p＜0.05）。上覆水各因子的影响作用显著，其中，pH、NH4+-N 、NO3--N 和DOC 对反硝化过程起促进作用且与反硝化速率相关度较高，DO 则抑制反硝化过程；周丛生物各指标均在第一主成分系统中表现出对反硝化速率的促进作用，而底泥中NIRK、NO3--N 和TN（S）在两个主成分系统中均表现出对反硝化速率显著正向贡献作用。

（2）“上覆水-周丛生物-沉积物”三相界面中影响反硝化速率的主要因素和程度不同。上覆水整体对反硝化过程的影响程度较大，周丛生物次之，底泥沉积物影响程度相对较小。主成分分析表明各因子之间互相影响，其中周丛生物同时影响上覆水和底泥土壤，因此在淹水底泥反硝化消纳氮素的研究过程中，应重视并厘清生物界面的影响机制及方式。