诺维氏梭菌α毒素单克隆抗体的制备与鉴定

孟德志，邢 斌，翁鸿宇，王秀媛，王 芳，杨玲玲， 柴同杰*，韦良孟*，戴培强

（1.山东农业大学动物科技院，山东 泰安 271018；2.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京； 3.潍坊市潍城区畜牧业发展中心，山东 潍坊；4.山东戴尔塔生物工程有限公司，山东 泰安）

诺维氏梭菌在自然界广泛存在，特别是土壤之中，饲草被芽胞体污染后，羊采食饲草，芽胞进入机体，由胃肠壁经目前未知的途径进入动物肝脏引起发病。大多数发病羊表现为突然死亡，病死羊尸体的皮下静脉呈现明显淤血，羊皮暗黑色，因此称为“黑疫”[1]。α毒素是由A型和B型诺维氏梭菌菌株产生的致死性、坏死性的毒素，α毒素致组织坏死，破坏细胞骨架，作用于L酰葡糖胺等[2]，它可引起羊黑疫等疾病，不仅影响我国畜牧业的发展，还会给人类的健康构成严重的威胁。诺维氏梭菌病具有发病急、病程短、死亡率较高的特点，患病动物往往得不到有效治疗而死亡。因此，诺维氏梭菌的快速检测方法以及治疗措施就显得尤为重要。本研究利用生物合成基因序列，制备重组蛋白，获得诺维氏梭菌α毒 素的单克隆抗体，为建立诺维氏梭菌的检测诊断技术奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、菌株及细胞B型诺维氏梭菌（ATCC 27606）、pET-21a（+）载体、纯化的重组α毒素蛋白、F0细胞等由山东农业大学环境微生物学实验室保存并提供；5～6周龄的雌性BALB/c小鼠购自济南市历下区山东大学实验动物中心；健康新西兰大白兔购自泰安种兔厂。

1.1.2 主要试剂透析袋、NC膜、HRP均购于德国Roche公司，HRP-DAB底物显色和TMB底物显色液等都购于天根生化科技有限公司；High AffinityNi-changed Resin购自康为世纪生物科技 有限公司；anti-His兔多抗、羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP均购自杭州华安生物公司；2× TSINGKE® Master Mix、DNA Marker购自青岛擎科梓熙生物科技有限公司；蛋白Marker、蛋白buffer购自北京聚合美生物科技有限公司、IMEM、HAT、HT培养基、NCTC生长因子、TEMED、葡萄糖、庖肉培养基购于北京索莱宝有限公司；Difco TM Cooked Meat Medium购自美国Becton Dickinson and Company；胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司；弗式完全佐剂、弗式不完全佐剂、细胞融合试剂PEG3 000、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒均购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 诺维氏梭菌重组蛋白的原核表达将获得的α毒素基因序列，连接至表达载体pET21a（+）。经测序验证基因序列大小为1 719 bp，所表达的氨基酸长度为573 aa。随后添加NdeI and XhoI酶切位点，连接到pET-21a（+）载体上。将测序合格的重组质粒转化BL21（DE3），接种到已加入氨苄青霉素的LB液体培养基中，大量表达并经Ni柱进行蛋白纯化，将洗涤液与洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，并用Western Blot验证重组蛋白表达情况。

1.2.2 单克隆抗体的制备（1）BALB/c小鼠的免疫。选择取6～8周龄与骨髓瘤细胞F0同源的雌性BALB/c小鼠，提前预饲一周消除应激。将纯化后的重组蛋白加弗氏佐剂乳化完全后，于第1天、第14天、第28天进行免疫，每只BALB/c小鼠腹腔注射60 µg重组蛋白，首免加倍。于第35天尾静脉采血和进行间接ELISA测定小鼠血清中的抗体效价；第42天加强免疫，小鼠腹腔注射60 mg不加佐剂纯化的重组蛋白进行加强免疫；第45天进行细胞融合。（2）饲养细胞、骨髓瘤细胞（F0）与脾细胞的制备。细胞融合前1 d或者2 d应先制备饲养层细胞，为细胞融合的生长提供有力的体外环境。在融合前14 d左右，将冻存的骨髓瘤细胞（F0）从液氮罐中取出，转至37 ℃ 水浴锅中反复摇晃3 min至细胞完全融化。离心弃上清冻存液，用已加双抗的含有10 % FBS的IMDM培养液重悬细胞，用移液枪将细胞转入细胞瓶内，后置于培养箱中进行培养。细胞融合过程中，制备的脾细胞的生长状态和数量都非常重要，取加强免疫后效价较高的BALB/c小鼠摘掉小鼠眼球并收集血液，制备小鼠阳性血清。将小鼠脱颈致死后浸泡于75 % 酒精中消毒10 min。将小鼠脾脏充分研磨，并加入IMDM培养基反复冲洗，使脾细胞尽可能多的冲洗下来。（3）细胞融合。将制备好的F0细胞和脾细胞混合，补加IMDM培养基至20 ml，1 000 r/min 离心10 min。离心后弃去上清，液体吸干净。用1 ml 50 % 的PEG 1 500进行细胞融合100 s。加入14 ml IMDM培养基，混匀，37 ℃ 水浴静置10 min。1 000 r/min离心10 min，弃上清。离心后，弃上清，向离心管中加入7 ml已预热的含20 % FBS的HAT培养基，重悬细胞沉淀。用HAT培养液将离心管中的液体补充至50 ml。待细胞混匀后，将细胞悬液加入到含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100 µl/孔。将96孔细胞培养板置于37 ℃、5 % CO2温箱中进行培养。（4）选择性培养及阳性杂交瘤细胞的亚克隆。用HAT选择性培养基进行细胞筛选，筛选出来的杂交瘤细胞孔中有多种杂交瘤细胞混合生长，其中只有少数细胞是分泌所需的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。因此，必须对所获得的杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆，以得到能够分泌单一抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞的亚克隆培养采用有限稀释法。

1.2.3 BALB/c小鼠单克隆抗体腹水的制备及纯化杂交瘤细胞具有亲代肿瘤细胞的遗传特性，如接种到同源性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就可以在宿主体内无限繁殖，直至死亡。小鼠腹水中含有大量的单克隆抗体，其效价远远高于细胞培养上清液。收集的单克隆抗体腹水使用正辛酸-硫酸铵方法进行纯化，利用SDS-PAGE对纯化效果进行分析，并进行浓度测定。测定单克隆抗体浓度的方法采用紫外分光光度计测定浓度：当吸光值260 nm/280 nm＜1.5时，则单克隆抗体浓度由下式计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm。

1.2.4 单克隆抗体的效价检测和特异性的鉴定用重组蛋白包被酶标板，采用间接ELISA操作方法对制备的单克隆抗体进行效价检测，其中二抗为HRP标记的羊抗鼠。利用Western Blot（免疫印迹）的方法，对单克隆抗体与重组毒素蛋白的特异性结合进行分析。

1.2.5 鼠单克隆抗体Ig亚类的鉴定按照试剂盒的步骤进行阳性杂交瘤细胞株单克隆抗体亚类鉴定，重链Mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA中OD值大于0.5，且比其他的OD值大3倍，则判定为阳性。轻链Igκ、Igλ阳性OD值大于0.5，则判定为阳性。重链或轻链检测出有2个或者2个以上的阳性值，则判定为其他亚型，该抗体亚型不合格。需要重新检测或者进行亚克隆。检测结果不能判定亚型的，按不合格处理。

2 结果与分析

2.1 诺维氏梭菌α毒素重组蛋白的原核表达

2.1.1 质粒构建及酶切鉴定对质粒进行酶切，结果如图1所示。泳道1为pET-21a（+）酶切结果，分子量大小大约在5 000 bp，泳道2为质粒DNA，分子量大小包含5 000 bp以及5 000 bp以上的两条带，表明目的片段已经重组到质粒。

图1 质粒构建酶切图

2.1.2 诺维氏梭菌重组蛋白表达结果将诺维氏梭菌α毒素构建好的质粒转入大肠杆菌进行重组蛋白的诱导表达，结果如图2所示，与诱导后破碎沉淀相比，目的蛋白在诱导后上清中表达量最大，表明该重组蛋白主要以可溶性蛋白形式表达。对破碎后的沉淀与破碎后的上清进行镍柱纯化，收集蛋白洗脱液用SDS-PAGE进行检测，结果如图2所示，重组蛋白在编号11破碎后的上清中浓度最高，可用于后续实验。

图2 诺维氏梭菌包涵体蛋白验证

2.1.3 诺维氏梭菌重组蛋Western Blot验证结果原核表达重组蛋白，对His标签进行Western Blot验证，经鉴定蛋白大小为66 kDa（图3）。

图3 蛋白Western Blot鉴定分析

2.2 诺维氏梭菌单克隆抗体的制备

2.2.1 免疫BALB/c小鼠的抗体效价检测结果BALB/c小鼠第三免疫后，尾静脉采血，分离纯化血清，以血清为一抗，通过间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价，结果均在1:64 000以上（表1）。

表1 小鼠抗体效价的测定结果

2.2.2 阳性杂交瘤细胞株的建立结果等到细胞融合成功一周后，利用间接ELISA方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，选择OD450nm值较高且细胞生长状态较好的阳性孔进行融合初筛和融合复筛，经过有限稀释法进行第一次亚克隆、第一次亚克隆复筛、第二次亚克隆、第二次亚克隆复筛，获得2株杂交瘤细胞株，分别将其命名为1978CT716.15.65、1978CT142.38.7。

2.3 单克隆抗体亚型鉴定结果

利用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒测定阳性杂交瘤细胞株亚型，单抗1978CT716.15.65、1978CT142.38.7都为IgG1，κ型（表2）。

表2 单克隆抗体亚类鉴定结果

2.4 腹水的纯化及浓度测定结果

利用雌性BALB/c小鼠腹腔获得腹水，将收集到的腹水采用正辛酸-硫酸铵方法纯化，对纯化的腹水进行SDS-PAGE凝胶电泳（图4），所纯化的腹水有两条很明显的蛋白条带：53 kDa左右的重链和25 kDa左右的轻链，结果表明腹水纯化的效果较好，且纯度均达到80 % 以上。根据蛋白计算公式：浓度（mg/ml）=1.45× OD280nm-0.74×OD260nm得到单克隆抗体的浓度为2.29 mg/ml。

图4 腹水的SDS-PAGE分析

2.5 单克隆抗体的特性鉴定

2.5.1 单克隆抗体效价的测定结果采用间接ELISA方法检测获得的单克隆抗体效价。1978CT142.38.7株杂交瘤细胞上清抗体效价达到1:1 600，1978CT716.15.65株杂交瘤细胞上清抗体效价达1:12 800。纯化的腹水抗体效价分别为1:64 000和1:512 000。利用腹水获得的单克隆抗体要比细胞上清效果更好（表3）。

表3 单克隆抗体效价的测定结果

2.5.2 单克隆抗体特异性鉴定结果采用间接的ELISA法分别检测2株单克隆抗体与重组毒素蛋白、产气荚膜梭菌α毒素蛋白的反应情况。结果表明，2株单克隆抗体均能和重组毒素蛋白结合，效价分别为1:512 000、1:64 000，但都不与无关蛋白结合（表4）。

表4 株单克隆抗体特异性检测结果

2.5.3 Western Blot实验结果用Western Blot方法分别检测了2株单抗与重组毒素反应（图5），NC膜上的特异性条带大约在66 kDa处，与重组蛋白的大小一致。所制得的单克隆抗体能特异性识别并结合重组毒素。

图5 单克隆抗体的Western Blot分析

3 讨论

羊黑疫又称“传染性坏死性肝炎”，是由B型诺维氏梭菌引起的绵羊、山羊的一种急性高度致死性毒血症。临床表现与羊快疫、羊肠毒血症等疾病极为相似。病程短促，大多数发病羊只表现为突然死亡，临床症状不明显[3]。部分病例可拖延1～2 d，但没有超过3 d的，病羊放牧时掉群，食欲废绝，精神沉郁，反刍停止，呼吸急促，体温41.5 ℃[4]，常昏睡俯卧，保持在这种状态下毫无痛苦地突然死去。我国自1964年首次发现该病以来[5]，出现了几次大流行，近几年呈地方性零星散发，但都未得到有效的预防、诊断、治疗，一直在对我国畜牧业造成损失。该病已经出现了近半个世纪，但我国对其研究少之又少，针对诺维氏梭菌培养、鉴定以及快速检测技术的研究几乎是一片空白。由于诺维氏梭菌的培养困难，产毒情况不稳定，本研究利用诺维氏梭菌α毒素N-末端结构域进行原核表达，获取所需重组蛋白。诺维氏梭菌重组蛋白的制备可以打破现在产毒困难的技术难题，加快对诺维氏梭菌病及其相关技术的研究。

杂交瘤细胞的体外培养过程中，因细胞具有密度依赖性的特性，细胞融合过程中需单独加入饲养层细胞以提高杂交瘤细胞的存活率。在本实验选用的饲养层细胞是小鼠腹腔巨噬细胞。巨噬细胞不仅可以为杂交瘤细胞提供生长因子、营养等物质，还可以将已死亡的细胞吞噬掉，为细胞融合提供良好的生存环境。使用雌性BALB/c小鼠腹腔获得腹水，因收集的腹水中含有少量的脂肪和无关蛋白等杂质，故先离心除去部分杂质，再采用正辛酸-硫酸铵方法对腹水进行纯化。本方法具有易操作，成本低，完整保留抗体活性等优点，并且本身对免疫球蛋白IgG1的纯化具有很好的效果，本研究所制备的2株杂交瘤细胞亚型均为IgG1、κ亚型，因此更适合使用本方法纯化。

经Western Blot验证，制备的单克隆抗体能与重组蛋白发生特异性的结合，且单克隆抗体纯度及效价较高，可以满足进一步制备诺维氏梭菌的快速检测试剂盒的需求。该研究获得的单克隆抗体在诺维氏梭菌的双夹心ELISA试剂盒的开发以及胶体金试剂盒的开发中起重要作用，在后期诺维氏梭菌可以稳定分泌毒素、可以获得阳性临床样品的情况下，可以利用所制备的单克隆抗体进行ELISA试剂盒及胶体金试剂条的组装构建等工作，为诺维氏梭菌的快速检测方法的建立提供了有力的技术储备。