miR-204-5p通过调节TLR2的表达减轻哮喘小鼠的炎症反应和气道重塑

董学峰，杨亚龙

(泉州医学高等专科学校内科教研室，福建 泉州 362000)

哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，受遗传及环境等多种因素的介导，由多基因参与调控，发病机制涉及多种炎性细胞、炎症因子及细胞因子[1-2]。近年来，由于生活环境的变化，哮喘的发病率呈上升趋势，据调查统计在全球范围内有近3亿哮喘患者，因此寻找治疗哮喘的有效方法具有重要意义[3]。miRNA是真核生物内源性具有调控功能的微小非编码RNA，通过靶向mRNA的转录后沉默来调节基因表达[4]，miR-204-5p作为一种潜在的癌症治疗分子，多项研究[5-7]表明，其通过外泌体转染至细胞内可调控抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡。有研究[8]报道，miR-204-5p的过表达可抑制肿瘤转换生长因子β1(TGF-β1)诱导的气道平滑肌细胞增殖和ECM的沉积，有效预防哮喘气道重塑。TLR2为参与非特异性免疫的TLRs家族成员之一，其与TLR4可识别侵入的微生物病原体，促进机体炎性细胞及炎症因子的释放，是哮喘易感性的主要影响因素[9]。本研究旨在通过探讨miR-204-5p对哮喘小鼠的炎症反应和气道重塑的影响及其可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器及试剂 离心机(Multifuge X1/X1R Pro，赛默飞)、DNA扩增仪(T100，BIORAD)实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480，罗氏诊断)、激光共聚焦显微镜(Echo REVOLUTION，ECHO)、紫外分光光度计(U-3900/3900H，日立)酶标仪(Multiskan FC，赛默飞)、灰度分析软件(alphaEaseFC，Alpha Innotech)。miR-204-5p激动剂(miR-204-5p agomir)，miR-204-5p拮抗剂(miR-204-5p antagomir)(货号：miR40000237-4-5、miR30000237-4-5，广州锐博)，BCA蛋白质定量试剂盒(货号：AR1110，武汉博士德生物工程限公司)，TLR2/ toll样受体2兔多克隆抗体、TGF-β 1/2兔多克隆抗体、NF-κB p65兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(货号：AF8181、AF0297、AF0246、A0208，上海碧云天)，Trizol、TaqManTMMicroRNA逆转录试剂盒及荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq TM(货号：RR036A、RR820A，TaKaRa)，小鼠白细胞介素4(IL-4)ELISA试剂盒、小鼠IL-5 ELISA试剂盒(货号：PI612、PI620，上海碧云天)，小鼠IL-13 ELISA试剂盒(货号：ml063123，上海酶联)。

1.1.2 实验动物 40只7周龄的SPF级昆明白雄性小鼠，体重(24.6±3.4)g，购自洛阳普万泰生物技术有限公司，室温保持在(25±2) ℃，湿度保持(55±5)%，动物自由饮食，保持12 h/d的昼夜循环。实验动物使用获得本院实验动物管理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 哮喘小鼠模型建立与分组 挑选10只作为对照组，其余30只小鼠于实验第1、3、5天腹腔注射200 μL致敏液[3 mg/mL OVA+ 5% Al(OH)3]，1次/d；于第6天开始以25 μL/10 g的剂量致敏液[6 mg/mL OVA+5% Al(OH)3]滴鼻激发引喘，1次/d，连续7 d，以激发时出现呼吸急促、腹肌抽动及肢体呈团等症状为哮喘模型成功[10]。建模成功后随机分为哮喘组、表达上调组、表达下调组，每组各10只。表达上调组小鼠尾静脉注射 30 mg/kg miR-204-5p agomir干预；表达下调组尾静脉注射 30 mg/kg miR-204-5p antagomir干预。对照组及哮喘组小鼠以同种方式注射等量0.9%生理盐水。干预结束后24 h颈椎脱臼法处死小鼠，剪开其颈部皮肤，于气管正中处剪一小口，插入气管套管。用磷酸盐缓冲液对支气管肺泡进行灌洗，来回冲洗3次，收集小鼠肺泡灌洗液(BALF)[11]，并留取小鼠肺组织，放入液氮中速冻，-80 ℃保存。

1.2.2 HE染色观察各组小鼠肺组织病理学改变 切取适量的肺组织，固定于10%的磷酸盐缓冲福尔马林溶液，经脱水、包埋后切片(切片厚度为5 μm)，行HE染色，中性树脂封片，显微镜下观察小鼠肺组织形态学变化。

1.2.3 RT-qPCR检测肺组织中miR-204-5p及TLR2 mRNA水平 取各组小鼠新鲜肺组织50 mg，Trizol法提取组织中的总RNA，分光光度计测定RNA的浓度。依据试剂盒说明逆转录合成cDNA，反应体系5 μL(5×Prime Script RT Master MiX 2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL)，轻柔混匀后加入DNA扩增仪中，反应条件为：37 ℃ 15 min反转录，85 ℃ 5 s反转录酶失活后，4 ℃保存。PCR扩增反应体系(20 μL)：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μL、PCR正反向引物(10 μM)各0.8 μL、 ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA 2 μL、灭菌蒸馏水6 μL，反应条件：预变性：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s循环40次，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s 融解，50 ℃ 30 s降温。以相对对量2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量，以U6为内参对miR-204-5p定量，以β-actin为内参对TLR2定量。miR-204-5p F：5′-AAC ACG CTT CCC TTT GTC ATC C-3′，R：5′-GCC UAU CCU ACU GUU UCC CUU-3′，扩增片段大小256 bp。U6 F：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，R：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′，扩增片段大小287 bp。TLR2 F：5′-AGA ATC AAT ACA ATA GAG GGA GAC-3′，R：5′-TCG ACT TTA GAC TTT GGG AC-3′，扩增片段大小354 bp。β-actin F：5′-ATG GAT GAC GAT ATC GCT G-3′，R：5′-ATG AGG TAG TCT GTC AGG-3′，扩增片段大小382 bp。

1.2.4 Western blot检测TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平 分别取各组小鼠的新鲜肺组织100 mg，4 ℃ PBS浸洗5 min，2 000 rpm离心10 min，去上清后加入200 μL RIPA 细胞裂解液与2 μL蛋白酶抑制剂混匀，4 ℃ 2 000 rpm离心10 min，收集总蛋白悬液。BCA蛋白质定量试剂盒所取组织中各蛋白的表达浓度。取蛋白溶液每孔上样50 μL，行SDS-PAGE电泳(12%或15%)，电泳仪分别按 80 V 20 min，120 V 60 min操作，至溴酚蓝刚达胶底部立刻关闭电泳仪。PVDF膜置于转移缓冲液中平衡后转膜，装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、PVDF膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板。接通电源，根据蛋白量大小，决定转膜需要的电压和时间。转移结束后取出PVDF膜，割取待测膜条做免疫印迹：将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50 s后，50%甲醇脱色至背景清晰，PBS反复洗膜3次，10%脱脂奶粉的PBST封闭液室温封闭1 h，弃封闭液，以5%脱脂奶粉的PBS配制的一抗(TLR2：1∶1 000、TGF-β1：1∶2 000、NF-κB p65：1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。回收一抗，加入辣根标记二抗(1∶1 000)室温慢摇下孵育1 h，弃二抗，PBST清洗条带15 min。以β-actin为内参，采取ECL发光试剂盒显影成像，然后使用Image J 软件分析各蛋白的相对表达。

1.2.5 ELISA法检测各组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子浓度 在EP管中加入1 mL BALF，1 000 rpm离心10 min，取上清。采用ELISA试剂盒检测各细胞因子浓度：分别取100 μL稀释样品与不同浓度标准品加入相应孔，封板膜封孔，室温孵育2 h，洗板5次并吸干水分后加入生物素化抗体100 μL/孔，封板膜封孔，室温孵育1 h，洗板5次并吸干水分后加入辣根过氧化物酶标记100 μL/孔，封板膜封孔，室温避光孵育20 min，洗板5次并吸干水分后加入显色剂TMB溶液100 μL/孔，封板膜封孔，室温避光孵育20 min，加入终止液50 μL/孔，混匀后立即测量A450值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠一般行为特征

对照组小鼠饮食及行为正常，呼吸节律平稳，无异常症状；哮喘模型小鼠出现呼吸急促、腹肌抽动及肢体呈团；miR-204-5p表达干预后，表达上调组小鼠呼吸急促、腹肌抽动现象减轻，表达下调组小鼠呼吸急促、腹肌抽动等现象加重，出现点头呼吸现象。

2.2 各组小鼠肺组织病理学改变

对照组小鼠肺组织及支气管结构正常，肺泡结构轮廓清晰，哮喘组、表达下调组小鼠气道壁严重增厚，细胞排列杂乱且疏松；表达上调组小鼠气道壁增厚情况明显减轻，细胞排列较为整齐，结构较为清晰。见图1。

2.3 各组小鼠肺组织中miR-204-5p及TLR2mRNA水平

与对照组相比，哮喘组小鼠的miR-204-5pmRNA表达水平下降(P<0.05)，TLR2 mRNA表达水平上升(P<0.05)；与哮喘组相比，表达上调组miR-204-5p mRNA表达水平上升(P<0.05)，TLR2 mRNA表达水平下降(P<0.05)；表达下调组miR-204-5p mRNA表达水平下降(P<0.05)，TLR2 mRNA表达水平上升(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肺组织中miR-204-5p及TLR2 mRNA水平

2.4 各组小鼠TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平

与对照组相比，各组小鼠TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平均上升(P<0.05)；与哮喘组相比，表达上调组TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平下降(P<0.05)，表达下调组TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平上升(P<0.05)。见图2。

2.5 各组小鼠肺组织IL-4、IL-5、IL-13等细胞炎症因子浓度

与对照组相比，各组小鼠的IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子浓度均上升(P<0.05)；与哮喘组相比，表达上调组IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子浓度下降(P<0.05)，表达下调组IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子浓度上升(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肺组织IL-4、IL-5、IL-13细胞炎症因子浓度

3 讨论

哮喘是常见的呼吸系统慢性气道疾病，主要表现为气道表皮细胞组织得损伤及脱落，且气道表皮细胞及组织损伤越严重，气道得高反应会越明显；主要发病原因之一为气道重塑，气道平滑肌细胞增殖和细胞外基质的产生在气道重塑过程中具有重要作用[12]。miRNA是真核生物内源性具有调控功能的微小非编码RNA，研究[13]发现，在哮喘的发病机制中有多种miRNA参与调控。相关研究[8]报道，miR-204-5p可通过调节Six1抑制TGF-β1诱导的气道平滑肌细胞增殖和细胞外基质产生，作为预防哮喘气道重塑的潜在治疗靶点。

本研究通过探讨miR-204-5p对哮喘小鼠的炎症反应和气道重塑的影响，并对其潜在的分子机制进行研究。结果显示，miR-204-5p的上调会抑制TLR2的表达，且与哮喘组相比，miR-204-5p表达上调组TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平下降(P<0.05)，miR-204-5p表达下调组TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平上升(P<0.05)。气道平滑肌细胞增生会直接导致气道壁增厚，从而影响气道反应性，使气流受限。TGF-β1具有强烈的促纤维化作用，可刺激气道平滑肌细胞增殖，促使气道重塑。作为启动及维持气道重塑的潜在关键因子，TGF-β1通过参与上皮间质转化、成纤维细胞分化等气道重塑的相关途径，并通过激活多条细胞内信号转导途径从而影响细胞周期，最终导致气道重塑的发生[14]。有研究[15]表明，TGF-β1可通过增强气道平滑肌细胞之间的兴奋-收缩偶联机制从而上调的信号转导蛋白Smad3和TGF-βRⅡ的表达导致平滑肌细胞增殖。而NF-κB为多条信号传导通路的枢纽，在调控哮喘气道重塑过程中同样具有重要作用，其活性的增强与哮喘的发生密切相关，可通过调控细胞炎症因子、生长因子、VCAM-1、ICAM-1及MMP等参与哮喘发病机制的多个环节。另研究[16]表明，TLR2/MyD88/NF-κB信号通路中关键蛋白的表达水平可有效影响机体的炎症反应，可参与气道炎症反应的发生及发展。TLR2为参与非特异性免疫的TLRs家族成员之一，是哮喘易感性的主要决定因素，多项研究均表明TLR2可通过介导下游的NF-κB通路和JNK信号分子参与过敏性气道炎症及支气管哮喘[17]。在本研究中，miR-204-5p的上调与TLR2的表达成负相关，且miR-204-5p表达上调组TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平均下降(P<0.05)，miR-204-5p表达下调组TGF-β1及NF-κB p65蛋白表达水平均上升(P<0.05)。因此推测miR-204-5p可通过调控TLR2抑制TGF-β1及NF-κB p65的表达，有效抑制气道平滑肌细胞增殖和细胞外基质的产生。

在过敏性气道炎症及支气管哮喘发生过程中，TLR2被激活与连接蛋白髓样分化蛋白的结合，从而激活下游的信号传递通路，启动细胞合成及释放炎性因子[18]，且NF-κB为一种多效转录因子，可对哮喘气道炎症过程中相关细胞炎症因子的基因转录水平进行调控[19]。本研究结果显示，表达上调组IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子浓度下降(P<0.05)，表达下调组IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子浓度上升(P<0.05)。IL-13、IL-4、IL-5为Th2型细胞炎症因子，Th1及Th2趋化因子的表达水平变化同哮喘患者机体免疫应答反应关系密切。在哮喘发病过程中，气道平滑肌处于活跃状态，平滑肌细胞过度增殖，合成分泌多种因子。在该过程中IL-4、IL-5等细胞炎症因子可通过ERK1/2通路与细胞外基质与气道平滑肌细胞上相应受体结合，促使气道平滑肌细胞的增殖，同时上调TGF-β1的水平，诱导纤维化的发生，并且导致炎症反应[2,20]。因此推测哮喘气道炎症的发生机制可能为miR-204-5p通过调控TLR2从而抑制Th2型细胞的活化及NF-κB的活性，减少IL-13、IL-4、IL-5等炎症因子的释放[20]。

综上所述，miR-204-5p可能通过调节TLR2的表达抑制哮喘小鼠由TGF-β1及NF-κB p65诱导的气道重塑，有效减轻小鼠的炎症反应，可作为预防哮喘气道重塑的潜在治疗靶点。