黄连解毒汤对阿尔茨海默病小鼠闭锁小带蛋白表达的影响

吕翰林，张英华，樊丽，周建文，李洋*

（1.齐齐哈尔医学院附属第一医院，黑龙江 齐齐哈尔 161041；2.齐齐哈尔医学院精神卫生学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.齐齐哈尔医学院医药科学研究院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

0 引言

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种随着年龄增加，不断发展的神经退行性疾病[1]。纵观世界人口老龄化的不断增加，有效的预防和治疗AD的发生发展就显得尤为重要。近年来，有研究学者发现，β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积是导致AD疾病发生的关键因素之一[2]，也有学者认为，当脑血管功能发生障碍时，Aβ沉积，无法通过血脑屏障（blood brain barrier，BBB）[3]，而BBB的重要结构为血管内皮细胞紧密连接，闭锁小带蛋白（ZO-1）是其重要成分[4]，上调ZO-1的表达，可能是降低Aβ沉积，改善AD的有效方法。祖国医药黄连解毒汤出自《肘后备急方》[5]，对脑血管内皮细胞具有保护作用，因此本实验通过检测黄连解毒汤对APP/PS1双转基因小鼠Aβ和ZO-1表达的影响，探讨对AD的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

5月龄清洁级APP/PS1双转基因小鼠，40只，C57BL/6小鼠，8只，购自南京生物医药研究院（SCXK（苏）2015-0001）。将小鼠分为6组：正常组、模型组、多奈哌齐组、黄连解毒汤低、中、高组，动物均饲养于齐齐哈尔医学院动物实验中心。

1.1.2 药物制备及分组给药

黄连解毒汤由黄连9g、黄芩6g、黄柏6g、栀子9g组成，齐齐哈尔医学院医药科学研究院制备成低、中和高剂量（1.5、3、6）g·kg-1·d-1。正常组和模型组给予生理盐水2mg·kg-1·d-1，多奈哌齐组给予0.001g·kg-1·d-1，连续灌胃45d。

1.1.3 仪器和试剂

ABI荧光定量PCR仪（美国Thermo，Q5），多功能酶标仪（奥地利Tecan，Spark），ZO-1（武汉博士德生物有限公司，PB9234）。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宫检测

圆形水池中加入奶粉作为背景，训练4d，每次60s。第5d撤去平台，记录小鼠穿越平台的次数，以及目标象限游程。

1.2.2 Western blot 检测

加裂解液将小鼠海马组织溶解，蛋白定量。电泳、电转、封闭、一抗Aβ（1:1000）、ZO-1（1:500）和β-actin（1:1000），4℃过夜，二抗，洗膜后显色，分析统计灰度值。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测

Trizol提总RNA，反转录cDNA，设计特异性引物，Aβ(F:5'-ATCGTGATTCCTTACCGTTGC-3'；R:3'-CTCTTCTCGCTGCATGTCTC-5')；ZO-1(F:5'-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3'，R:3'-GCCCTCCTTTTAACACATCAGA-5')；GAPDH(F:5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'，R:3'-CCACAGGATTCCATACCCAA-5')，加入荧光材料SYBR Green I，实时监测得到数据，采用2-ΔΔCt法计算分析数据。

1.3 观察指标

1.3.1 穿越平台次数和目标象限游泳距离

穿越平台次数的多少是评价学习保持能力的重要指标；目标象限游程评价记忆能力的改善。

1.3.2 Aβ和ZO-1蛋白的表达

判断APP/PS1小鼠学习记忆的改善可通过检测Aβ和ZO-1蛋白的表达实现，观察其相关性。

1.3.3 Aβ和ZO-1 mRNA的表达

Aβ和ZO-1 mRNA的表达为了检测基因水平的变化，判断是否通过调控基因水平，改善小鼠的记忆功能。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 水迷宫结果

2.1.1 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响

与正常组比较，模型组小鼠穿越平台次数和目标象限游程均减少（P<0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和HLJDT高剂量组小鼠穿越平台次数和目标象限游程均增加（P<0.05），HLJDT低、中剂量组无明显差异（P>0.05），见表1。

表1 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响（，n=8）

表1 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响（，n=8）

注：与正常组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05，3)P>0.05

2.2 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠海马区Aβ和ZO-1蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠海马区Aβ蛋白表达升高（P<0.05），ZO-1蛋白表达降低（P<0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和HLJDT高剂量组小鼠海马区Aβ蛋白表达降低（P<0.05），ZO-1蛋白表达升高（P<0.05），HLJDT低、中剂量组Aβ和ZO-1蛋白表达无明显差异（P>0.05），见表2、图1。

图1 Western blot 检测Aβ和ZO-1蛋白在各组小鼠脑海马区表达水平

表2 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ和ZO-1蛋白表达的影响（，n=8）

表2 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ和ZO-1蛋白表达的影响（，n=8）

注：与正常组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05，3)P>0.05

2.3 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠海马区Aβ和ZO-1 m RNA表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠海马区Aβ mRNA表达升高（P<0.05），ZO-1 mRNA表达降低（P<0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和HLJDT高剂量组小鼠海马区Aβ mRNA表达降低（P<0.05），ZO-1 mRNA表达升高（P<0.05），HLJDT低、中剂量组Aβ和ZO-1 mRNA表达无明显差异（P>0.05），见表3。

表3 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ和ZO-1 mRNA表达的影响（，n=8）

表3 HLJDT对APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ和ZO-1 mRNA表达的影响（，n=8）

注：与正常组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05，3)P>0.05

3 讨论

随着人口老龄化逐年增长，越来越多的老年人患AD疾病。预防和治疗AD也成为当今研究的热点话题。目前治疗AD的药物大多都只能缓解症状，不能根治，同时还伴有一定的副作用。而祖国医药，能从多方向入手，多靶点进行疾病的治疗，适合AD疾病多因素发展的特点。黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味药组成，多药合用，具有补气血，清热解毒的功效[6]，正适用于本虚标实的AD疾病，在前期研究结果[7]中也有所体现。

研究学者提出神经血管假说[8]，假说认为AD复杂的病理过程，是由神经血管改变引起的，血脑屏障清除Aβ异常，导致Aβ沉积，最终引起AD疾病的发生[9]。闭锁小带蛋白（ZO-1）是维持血脑屏障完整性的重要结构[10]，研究表明，上调ZO-1，可以减轻血脑屏障的破坏，Aβ沉积减少，改善AD症状[11]。因此，上调ZO-1表达，降低Aβ表达，可能是治疗AD的有效方法。本实验结果说明HLJDT可改善AD小鼠的学习记忆能力，HLJDT高剂量组更为有效。HLJDT可通过升高ZO-1表达，抑制Aβ表达，保护血脑屏障完整性，从而发挥对AD的保护作用。