叔丁醇体系中化学酶法催化α-蒎烯环氧化

刘永飞，苏伟，梁琪琪，李青云，2，刘幽燕，2，唐爱星，2

（1 广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004；2 广西生物炼制重点实验室，广西 南宁 530007）

-蒎烯（-pinene，CH）是我国的优势资源松节油的主要成分，是自然界中存在量最多的单萜烯烃之一。-蒎烯可以通过化学法、生物法和化学酶法等方法合成-蒎烯环氧化物（也叫2,3-环氧蒎烷），这是一种具有清凉气息的重要香料中间体，可进一步合成两百多种香料或有生理活性的精细化学品。当前工业化的-蒎烯环氧化反应用强酸作为催化剂，反应速度快，但常伴随着许多副反应的发生，而且酸易造成设备腐蚀。酶催化具有反应条件温和、选择性高的特点，但直接使用酶催化烯烃环氧化往往需要使用相对昂贵的单加氧酶类，如细胞色素P450、葡萄糖单加氧酶等。而化学酶法环氧化使用相对廉价的脂肪酶做催化剂，反应一共分为两步：首先酰基供体（脂肪酸或脂肪酸酯）和过氧化氢在脂肪酶的催化下生成过氧羧酸，然后依据Prileshajev 反应原理，过氧羧酸自催化烯烃生成环氧化物（如图1）。由于化学酶法环氧化结合了化学法和生物法的优点，得到了研究者的广泛关注。

图1 脂肪酶催化α-蒎烯环氧化反应的机理

目前，化学酶法蒎烯环氧化的研究基本都是在两相体系中进行的，-蒎烯、酰基供体等疏水性底物溶解在有机溶剂（例如甲苯）中，与氧化剂过氧化氢水溶液构成有机-水“双相”反应体系。但双相反应体系受制于两相间的传质速率影响，导致环氧化反应速率低，而且还存在着酶与高浓度的水相过氧化氢直接接触易失活的问题。一些研究者通过改变反应物浓度、酰基供体类型等因素，可以部分优化环氧化反应性能；而Bhalerao 等在研究脂肪酶催化大豆油环氧化反应时，为了加快环氧化反应速度，运用超声辅助的方法来强化界面处过氧化氢的物质传输。然而，由于水相高浓度过氧化氢的存在，双相体系中固定化脂肪酶的稳定性仍然面临挑战。有研究人员采用尿素-过氧化氢（UHP）取代含水的过氧化氢水溶液，通过过氧化氢的缓慢释放降低对酶的毒害作用，提高了脂肪酶的稳定性。此外，Meyer 等还设计了一种蒎烯环氧化的连续搅拌釜式反应器，以预饱和过氧化氢的乙酸乙酯作为反应器的流动相。由于没有水性过氧化氢，反应器可以稳定运行17 天，转化率约为60%。这些实验成功地提高了固定化脂肪酶的稳定性，但牺牲了环氧化反应效率。周鹏飞等报道了一种天然低共熔溶剂（DES）体系，可以将烯烃、酰基供体和过氧化氢融在一起形成单相体系，以Novozym435催化环氧化时转化率最高为72.4%。虽然DES 体系中也存在着脂肪酶易失活和流动性低的问题，但是构建单相体系的方法提供了一个解决问题的思路。

水互溶性有机溶剂，如醇类、乙腈、丙酮等，既可以与水互溶，也能溶解疏水性有机物，可以使烯烃环氧化反应的疏水性底物与水性过氧化氢较好地融为一体，构建单相反应体系。虽然过去通常认为亲水性有机溶剂易于夺取酶的结合水从而使酶失活，但是近年来的研究表明，带羟基官能团的溶剂可以导致酶的活化，而且酶的稳定性与羟基的数量和位置有关。Zhao等观察到南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）在叔丁醇溶液中高效的催化活性，而且叔丁醇对酶的抑制性较小，作为酯化反应底物的反应性也较低。分子动力学模拟表明，CALB在叔丁醇中的高相容性是由几个原因造成的，例如叔丁醇中蛋白质的高弹性、维持良好的底物入口大小和酶的结合口袋大小，以及酶活性中心Ser105的氢键保护。本文尝试采用叔丁醇为溶剂，构建蒎烯环氧化的单相体系，以期消除界面影响，降低水性过氧化氢对酶的失活，提高蒎烯环氧化的效率，再根据单相体系脂肪酶催化-蒎烯环氧化的特性，设计适用于单相体系的-蒎烯环氧化的反应器，探索其工业化应用的潜力。

1 实验

1.1 实验材料

-蒎烯和十二烷，分析纯，阿拉丁；Novozym435 购自诺维信生物技术有限公司；-蒎烯环氧化物，GC 标准品，Extrasynthese（法国）；过氧化氢（30%），分析试剂级，上海麦克林生化科技有限公司；乙酸乙酯，分析纯，中国大茂化学试剂厂；柠檬酸三钠二水合物（NaCHO），分析纯，西陇科学股份有限公司；碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 叔丁醇体系脂肪酶催化α-蒎烯环氧化的条件优化

配制含-蒎烯0.3mol/L、乙酸乙酯3.5mol/L 和0.5mol/L 过氧化氢（30%）的2mL 叔丁醇溶液，再在溶液中加入0.6mmol 束酸剂（柠檬酸三钠）和40mg Novozym435，置于平行合成仪中，40℃、150r/min 下反应90min 后取样，同时设置不含酶的空白组。将样品在14000下离心5min，加入内标液进行气相分析测定转化率和收率。

（1）乙酸乙酯浓度的影响 调整乙酸乙酯浓度分别为1～4mol/L，其余条件不变，考察酰基供体乙酸乙酯对蒎烯环氧化的影响。

（2）过氧化氢浓度的影响 调整过氧化氢浓度分别为0.2～1mol/L，其余条件不变，考察氧化剂过氧化氢对蒎烯环氧化的影响。

（3）束酸剂种类的影响 调整束酸剂种类分别为碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸氢二钠、柠檬酸三钠和磷酸二氢钠，其余条件不变，考察束酸剂对蒎烯环氧化的影响。

1.3 单相和双相体系的环氧化反应比较

单相体系：9mL 叔丁醇中含有-蒎烯（0.3mol/L）、乙酸乙酯（3.5mol/L），然后添加0.49mL 过 氧 化 氢（30%）， 随 后 加 入180mg Novozym435和0.6mmol 柠檬酸三钠，40℃置于平行合成仪中催化反应，间隔取样，气相分析测定转化率和收率。

甲苯-水双相体系：9mL 甲苯中含有-蒎烯（0.3mol/L）、乙酸乙酯（3.5mol/L），然后添加0.49mL 过氧化氢（质量分数30%），随后加入180mg Novozym435 和0.6mmol 柠檬酸三钠，40℃置于平行合成仪中催化反应，间隔取样，气相分析测定转化率和收率。

1.4 单相体系中脂肪酶的可重用性

按照1.2 节的反应条件进行蒎烯环氧化反应，反应结束后，在14000下离心5min，取100μL 溶液进行气相分析，并分离固定化酶。在下一批次反应之前，固定化脂肪酶按水-水-叔丁醇的顺序洗涤。相对活力被定义为每批次使用的环氧化转化率与第一次转化率的比率。

1.5 CSTR反应器工艺条件优化

在釜式反应器中配制含0.3mol/L-蒎烯、适量过氧化氢（0.1～1.5mol/L）、适量乙酸乙酯（2～4mol/L）的叔丁醇溶液，加入适量固定化酶（0.5～3g）和1g 柠檬酸三钠，水浴40℃，开搅拌运行反应器，每隔半小时取反应器内的溶液200μL 待测，3h 后，泵运行，开始补充与初始相同浓度的底物溶液，产物从上口流出，保持进料和出料速度一致，继续每隔0.5h取出口物料200μL待测。以反应器达到稳定状态时的转化率和收率数据作为该实验条件下的实验结果。

空白组对照：不加酶，其他条件不变，每隔0.5h测定进料和出料的-蒎烯浓度。

1.6 CSTR反应器的长期运行性能

配制含0.3mol/L-蒎烯、0.5mol/L 过氧化氢、3.5mol/L 乙酸乙酯的叔丁醇溶液作为反应器流动相，在釜式反应器中加入2.0g 固定化酶和1g 柠檬酸三钠，设定物料流率为0.27mL/min（即物料平均停留时间3h），水浴40℃，启动反应器运行，间隔取出口物料200μL 待测，直至转化率和收率开始下降。

1.7 气相检测方法

使用气相色谱（GC-FID）进行分析。毛细管柱 的 型 号 为 HP-1 （Αgilent， 30m×0.25mm×0.25μm），注射室和检测器的温度分别为220℃和230℃，分流比为1∶20。升温程序为100℃时保持3min，然后以20℃/min 到160℃，然后保持1min。产物通过与标准品对比进行鉴定。十二烷作为内标物，以内标法来测定-蒎烯和-蒎烯环氧化物的含量。首先制备了含有十二烷的参考溶液（RS），取100μL 待测样品与100μL RS 充分混合，然后取1μL注入气相色谱。

1.8 实验装置

该装置包括一个带磁力搅拌子的连续搅拌釜式反应器（运行体积=50mL）、磁力搅拌恒温水浴锅、恒流泵和两个密封的溶液罐，反应器的进出口由软管连接，反应器与原料罐和产品罐之间各装有一个恒流泵。反应器的进出口处，各有一个不锈钢网筛，以防止酶颗粒进入软管。CSTR 反应器装置如图2所示。

图2 CSTR装置示意图

2 结果与讨论

2.1 乙酸乙酯浓度的影响

在不同乙酸乙酯浓度下，叔丁醇单相体系环氧化转化率和收率如图3。随着乙酸乙酯浓度的增大，转化率和收率都在逐渐提高，当浓度为3.5mol/L时，环氧化转化率和收率达到最高，分别为93%和86%。脂肪酶催化的过酸生成反应的机理已经被研究和报道，酰基供体是化学-酶法环氧化的重要媒介，贯穿于两步反应当中，其不仅影响着过酸的生成同时影响着催化烯烃环氧化的效率。如Xu 等发现使用内酯作为酰基供体可能有助于维持酶的活力和稳定性，而且通过调节酰基供体的量，可以促进过酸的形成，从而提高环氧化的性能。乙酸乙酯作为酰基供体，其浓度越高，催化产生的过氧乙酸越多，环氧化反应的转化率就越高；而当酰基供体达到一定量时，酶催化也达到饱和，其环氧化转化率和收率都不再提高，基于资源合理化利用考虑，在单相体系脂肪酶催化-蒎烯环氧化中选择乙酸乙酯的最适浓度为3.5mol/L。

图3 不同乙酸乙酯浓度对α-蒎烯环氧化反应的影响

2.2 过氧化氢浓度的影响

过氧化氢由于价格相对便宜，副产物是水从而具有无污染、原子经济性高的优点，是蒎烯环氧化中使用最普遍的一种氧化剂，但过氧化氢即作为底物又作为酶失活剂，其浓度对环氧化反应的最终转化率和收率都有重要的影响。在叔丁醇体系中，不同浓度过氧化氢中进行脂肪酶催化-蒎烯环氧化的结果如图4所示。在低浓度下，随着过氧化氢浓度的升高，环氧化反应的转化率和收率迅速升高，直至0.5mol/L时，转化率和收率达到最大，分别为92%和88%。继续升高过氧化氢浓度，转化率和收率不再增加并开始缓慢减弱。通常过氧化氢浓度决定脂肪酶催化-蒎烯环氧化的反应速率，但是高浓度的过氧化氢会使酶失活，从而会限制酶促反应。Skouridou等研究了过氧化氢的浓度对蒎烯环氧化反应的影响，发现随着过氧化氢加入量的增加，脂肪酶的稳定性变差。Aouf等报道了一项过氧化氢失活青梅脂肪酶的机理研究，结论表明过氧化氢与脂肪酶中心之间通过氢键的结合是限制脂肪酶过水解能力，从而导致了脂肪酶失活的原因。因此，适合叔丁醇单相体系脂肪酶催化-蒎烯环氧化的过氧化氢浓度为0.5mol/L。

图4 不同过氧化氢浓度对α-蒎烯环氧化反应的影响

2.3 束酸剂种类的影响

化学酶法催化蒎烯环氧化反应产生的酸性副产物会导致环氧蒎烷发生水解或者异构等现象，从而降低反应的收率，通常加入束酸剂来降低酸性副产物的影响。本实验考察了碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸氢二钠、柠檬酸三钠和磷酸二氢钠等五种无机盐作为束酸剂的影响，结果如图5所示。与无束酸剂体系相比，添加束酸剂后环氧化反应的收率明显更高，表明束酸剂可抑制产物分解，从而可提高蒎烯环氧化的收率。其中，当添加碳酸氢钠和碳酸钠时，环氧化反应的转化率有明显降低，其原因可能与碳酸钠为高碱性（高p）的盐，易使酶失活，不利于环氧化反应有关。而添加磷酸氢二钠、柠檬酸三钠和磷酸二氢钠作为束酸剂时，转化率基本维持不变，收率都有明显提升，其中柠檬酸三钠的收率最高，可达88%，所以后续实验选用柠檬酸三钠作为束酸剂。

图5 束酸剂种类对α-蒎烯环氧化的影响

2.4 双相体系和单相体系蒎烯环氧化的比较

图6为甲苯-水双相体系的脂肪酶催化-蒎烯环氧化反应进程，在甲苯-水双相体系中，随着反应时间的增加，环氧化反应的转化率、收率先是快速升高，90min时分别达到65%和62%，然后转化率基本保持稳定而收率开始下降，表明随着反应的进行，副产物有机酸积累导致产物部分分解。另外，有机相中的过氧化氢浓度随反应时间缓慢增加，到60min 后，增加至0.27mol/L 并保持不变，这是由于相界面的传质阻力使得过氧化氢从水相扩散到有机相需要一定时间，同时由于过氧化氢在甲苯中的溶解度不高，使得参与环氧化反应的过氧化氢浓度低，这也是导致双相体系环氧化反应转化率和收率较低的原因。图7展示了叔丁醇单相体系中脂肪酶催化-蒎烯环氧化反应进程，随着反应时间增加，转化率和收率也逐渐增大，90min时转化率和收率分别可达到93%和88%，环氧化效果明显高于双相（甲苯-水）体系。另外，过氧化氢浓度从开始的0.5mol/L 降为最后的0.2mol/L，表明反应始终在较高的过氧化氢浓度下进行，这可能是单相体系转化率和收率更高的原因。而且在叔丁醇单相体系中环氧化产物没有明显的分解现象，表明叔丁醇体系对抑制酸分解作用也是有利的。

图6 甲苯-水相中α-蒎烯环氧化反应

图7 叔丁醇中α-蒎烯环氧化反应

2.5 叔丁醇体系中脂肪酶的可重用性

可重用性也是评价固定化脂肪酶催化-蒎烯环氧化体系优越性的一项重要指标。由图8 可知，当过氧化氢浓度为0.5mol/L 时，Novozym435 经过6批次重用，其相对活力仍有64%，这个结果要明显高于文献报道的双相反应体系，如Ankudey 等以乙酸乙酯为溶剂，过氧化氢水溶液为氧化剂构建双相反应体系，以Novozym435 催化蒎烯环氧化时，固定化酶的活性在第二次使用后就完全消失。Skouridou 等在 甲 苯- 水 两 相 体 系 中 以Novozym435 催化-蒎烯环氧化，产率最高仅为65%，且固定化酶重复使用5 批次后活力仅剩40%。可见，在双相体系中，脂肪酶由于接触水相中高浓度的过氧化氢从而极易失活。而在叔丁醇单相体系中，过氧化氢分散在醇溶剂中，降低了初始浓度，减弱了对酶的失活作用。因此，在叔丁醇体系中，固定化脂肪酶Novozym435 具有良好的稳定性，从而具有进一步工业开发利用的潜力。

2.6 CSTR反应器中α-蒎烯环氧化工艺条件优化

连续搅拌釜式反应器具有操作温度和底物浓度易控制、反应釜中物料浓度处处相等并且等于反应器出口低浓度的特点，有利于降低反应体系过氧化氢浓度，减少对酶的失活作用，有利于反应器长期稳定运行。本实验在确定进料蒎烯浓度基础上，对CSTR 反应器的给酶量和停留时间以及进料的过氧化氢浓度进行了优化，结果如图8所示。反应器的转化率和收率先是随酶量增大而提高[图9(a)]，当酶量为2.5g，转化率达到最高值，但此时选择性低于2.0g；当酶量升至3.0g时，平衡转化率并不能继续提高，表明环氧化反应能力已达到饱和，继续增加酶量并不能提高环氧化能力；当酶量2.0g时收率为最高79%，其选择性也达到最高为96%，所以选用2.0g酶量为最佳反应酶量。由图9(b)，叔丁醇单相体系中过氧化氢浓度小于1mol/L 时，反应器的转化率随过氧化氢浓度上升而上升，而在过氧化氢为1.5mol/L时，转化率和收率发生了急速下降，表明高浓度的过氧化氢已经导致脂肪酶的失活。在过氧化氢为1mol/L时，转化率达到最高95%，但其收率（70%）和选择性（74%）不如过氧化氢浓度为0.5mol/L 时（收率78%、选择性94%），而且考虑到过氧化氢对酶的失活作用影响反应器长期运行的稳定性，所以选用0.5mol/L 为最适过氧化氢浓度。图9(c)展示了停留时间对CSTR 反应器中叔丁醇单相体系-蒎烯环氧化的影响，结果表明转化率随停留时间的增大而增大，但是收率和选择性在停留时间小于3h 前是增大，但当停留时间超过3h 后，收率和选择性出现了下降，因为过长的停留时间会导致环氧化产物环氧蒎烷在体系中分解，引起收率下降，所以釜式反应器的停留时间不宜过长。因此釜式反应器的最佳工艺条件为酶量为2.0g、最佳过氧化氢浓度为0.5mol/L、最佳停留时间为3h，此时反应器的转化率可达83%，收率可达79%。

图8 Novozym435在异丙醇系统中脂肪酶介导的环氧化反应中的重复使用稳定性

图9 CSTR反应器中酶量、过氧化氢浓度及停留时间对叔丁醇单相体系α-蒎烯环氧化的影响

2.7 CSTR反应器中α-蒎烯环氧化的长期运行

在最优工艺条件下进行釜式反应器的长期运行，结果如图10所示。结果表明CSTR反应器能够稳定运行10 天左右，在此期间转化率可以保持70%以上，收率维持在55%以上，但在10 天后，转化率和收率开始下降，15天后，收率仅有35%，表明此时酶开始失活。Meyer 等也设计一种-蒎烯环氧化CSTR 工艺，反应条件为温度30℃、CALB 酶浓度11g/L、停留时间1.5h、氧化氢浓度0.7mol/L，最高收率为62%，在运行4 天后，其收率已为0，通过间歇式补加酶的方式，反应器可稳定运行17天，收率稳定在60%左右。

图10 CSTR反应器中单相体系脂肪酶催化α-蒎烯环氧化的长期运行

3 结论

以叔丁醇为溶剂进行化学酶法催化-蒎烯环氧化，最优工艺条件为乙酸乙酯浓度3.5mol/L，过氧化氢浓度0.5mol/L，束酸剂为0.6mmol 柠檬酸三钠，蒎烯环氧化最高转化率为92%、最高收率为88%。在此单相体系中，Novozym435 重用6 次后，仍保持64%的相对活力，表明该体系有利于保护酶的活性。利用自主设计的连续搅拌釜式反应器用于脂肪酶催化-蒎烯环氧化，反应器运行体积为50mL，进料-蒎烯浓度为0.3mol/L 时，乙酸乙酯浓度为3.5mol/L 时，最优工艺条件为酶量为2.0g、过氧化氢浓度为0.5mol/L、停留时间为3h。在此条件下反应器连续稳定运行10 天，转化率可以保持70%以上，收率维持在55%以上。