基于膜技术分离纯化乳清蛋白的研究进展

马镓莉，卢会霞，苗晓雪

（天津市跨介质复合污染环境治理技术重点实验室，南开大学环境科学与工程学院，天津 300350）

乳品工业是食品工业中污染最严重的行业之一，其中乳清是干酪生产的主要副产物，是一种淡黄色或绿色的不透明液体，其高有机负荷被认为是乳制品废水中的重要污染物来源。目前对于乳制品废水的处理通常采用生化法，该方法虽能有效地降低废水中的化学需氧量（COD）和生物需氧量（BOD），使污水达标排放，但废水中具有经济价值的蛋白、脂肪、糖等物质却得不到有效回收而造成了资源浪费。国家《乳制品工业产业政策》也明确提出了对乳清综合利用技术的支持。因此，将乳清中的蛋白进行回收利用对于乳制品行业的节能减排以及可持续发展意义重大。

乳清蛋白富含必要氨基酸，易于消化吸收，是一种优质蛋白，素有“蛋白质之王”之称。乳清蛋白除了具有增稠、起泡等功能特性之外，乳清蛋白浓缩物或其中的单一蛋白还具有独特的营养和医学价值而广泛用于食品和营养保健品行业。近年来，对于乳清蛋白的分离和纯化方面的研究日益受到了企业和众多研究者的关注（图1）。

图1 通过Web of Science检索与“separation and isolation of whey protein”“membrane and whey protein”相关的发文数量

自20 世纪50 年代以来，许多技术被用于分离纯化乳清蛋白。但盐析、酸碱沉淀、化学沉淀、热蒸发等早期技术大多只能用于实验室规模，产量极低，且酸、热等条件会造成蛋白质变性，失去营养和功能特性。因此目前分离乳清蛋白的主要方法是色谱法和膜分离法。其中离子交换色谱法与膜分离法相结合也可用于大规模分离乳清蛋白，例如Maciel 等采用微滤、超滤、色谱法相结合的方法分离甜乳清中的乳铁蛋白。对乳清先微滤再超滤，能够预纯化乳铁蛋白至1.1mg/L，最后通过阳离子交换色谱最终得到乳铁蛋白浓度为17.4mg/mL、纯度为92.7%、回收率为87.0%。虽然色谱法具有高分离性能，分离出的蛋白纯度高，但它循环时间长、成本太高，且存在树脂再生、水和化学消耗等问题。因此，膜技术因其简单、节能、收率高、无二次污染、易于工业放大以及不会改变蛋白的性状和营养价值，回收过程没有相变的发生等优点成为蛋白质分离领域最有前景的分离方法。本文在对乳清及其中所含蛋白特性分析的基础上，总结近年来膜技术在乳清蛋白分离中的应用研究，重点介绍电驱动膜技术在乳清蛋白分离和资源化方面的应用最新进展。

1 乳清及乳清蛋白的特性和应用

乳清是干酪生产中的副产物，随着干酪产量的不断增加，每生产1吨干酪会排放9吨乳清，世界乳清产量每年(1.8～1.9)亿吨，年增长率为1.0%～2.0%。但目前只有50%的乳清被处理用作动物饲料和食物等，其中仍有40%～50%的乳清作为废水排放。乳清的有机负荷非常高，BOD 为30～50g/L、COD为60～80g/L，因此在乳清废水排放前必须进行严格的处理，降低其中的有机物含量，确保达标排放。传统的乳清处理方法可以通过物理、化学、生物等多种方法处理，也有研究者采用膜技术处理乳清废水，如Mansor等研发了一种新型复合膜，建立了一种经济有效的奶酪乳清废水处理方法，该方法对乳清废水中的COD、BOD、总悬浮物和浊度的去除率分别达到为99.8%、99.7%、99.8%和99.6%。但上述方法是将乳清作为废水，处理的目的是为了达标排放或水资源的回收利用，而无法实现乳清中蛋白质、乳糖等功能活性物质的资源化回收利用。实际上乳清可通过不同途径进行资源化利用（图2），即可以直接将乳清作为化肥或饲料处置；或者通过发酵工艺来获得增值产品，如有机酸、酶、细菌素等；或者将乳清看作是一种蛋白质来源，采用适当的分离和纯化技术对其中的蛋白质和乳糖等高价值的化合物进行回收利用，与其他加工技术相结合生产出多种乳清产品，如乳清粉、还原糖乳清、脱盐乳清、乳清蛋白浓缩物（WPC）、乳清蛋白分离物（WPI）、乳铁蛋白和糖巨肽等。实现乳清的资源化利用具有重要的环境意义和经济效益。

图2 乳清的几种利用途径

乳清中的营养物质占原料奶的55%（质量分数，下同），其中固形物含量约6%～7%、粗蛋白0.6%～0.8%、粗脂肪0.3%，乳糖3%～5%。根据生产的奶酪类型和使用酶的不同，乳清可以分为两类：甜乳清和酸性乳清。甜乳清是生产凝乳酶类干酪过程中产生的，而酸性乳清是在矿物质或乳酸凝结的制作过程产生。当然，乳清的组成和特性很大程度上也取决于牛奶的来源、动物的饲料、所用的加工方法、季节和哺乳期等。此外，不同的发酵工艺和时间将导致乳清的pH 及成分有所不同；不同热处理温度对乳清中蛋白质和脂肪含量也有所影响。

乳清蛋白是多种功能性蛋白的混合物，主要成分是α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白，次要成分是乳过氧化酶、乳铁蛋白、乳脂肪球膜、蛋白胨、生长因子和其他生物活性因子及酶。乳清蛋白中各类蛋白的含量及特性见表1。其中α-乳白蛋白对热最稳定，是唯一能结合钙的乳清蛋白成分，其结构及氨基酸比例与人乳相似度极高，因此在婴幼儿奶粉中有广泛应用。但β-乳球蛋白是致敏蛋白，降低β-乳球蛋白是提升牛乳产品母乳化的有效方法。乳铁蛋白是一种可结合并运输铁离子的蛋白质，具有免疫调节功能，可参与阻断过度的免疫反应以及促进婴幼儿自身免疫系统的发育成熟，对预防新生儿感染有一定作用而被大量应用在婴幼儿配方奶粉中。免疫球蛋白是乳清蛋白质中热敏感性最强的一种蛋白质，通常以单体或多聚体的形式存在。目前已实现了从乳清蛋白中分离乳铁蛋白、免疫球蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等单个蛋白的分离。但是，分离的纯度和规模仍然较低，尤其是分子量比较接近的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白更难分离。我国的乳清蛋白开发应用尚处于起步阶段，功能性明确、技术含量较高的乳清蛋白质保健品目前在市场上还很少见。随着工艺技术的进一步成熟，今后乳清蛋白的应用将会不断扩展到婴幼儿食品、中老年保健食品、免疫功能食品、减肥食品和运动营养食品以及医疗等领域。因此，开发高效、易于工业放大、环境友好的乳清蛋白分离技术，获得更多的乳清蛋白产品，对于健康中国战略的实施意义重大。

表1 乳清蛋白的组成及特性[3,27-28]

2 压力驱动膜在乳清蛋白分离中的应用

2.1 超滤过程在乳清蛋白分离中的应用

膜技术相对于其他分离乳清蛋白的技术最大的优势在于成本效益高，运行过程中不会发生相变，占地面积小，且易于放大，因此，在乳清蛋白分离浓缩中的应用日益广泛。超滤技术能够在最大程度上将乳清中的营养成分资源化利用，是乳清蛋白分离回收中应用最为普遍的膜技术。超滤膜允许矿物质、水、乳糖和其他低分子量化合物通过，而将大分子蛋白质截留，从而实现蛋白的分离和浓缩。陈婷等早期的研究证明使用超滤技术分离和浓缩乳清得到具有经济效益的乳清蛋白粉是可行的，按固形物衡算，每吨乳清可以回收5.13kg 乳清蛋白粉，乳清中蛋白的回收率高达82.74%。超滤最常用于制备WPC 和WPI 等产品。WPC 或WPI 为蛋白混合物，基本含有全部乳清蛋白。目前主要通过超滤和喷雾干燥进行大规模工业生产，蛋白质含量一般为35%～85%。

也有一些研究者尝试从乳清中分离和制备出具有抗高血压、抗氧化活性和抗肥胖潜力等独特价值的单个功能活性蛋白，例如α-乳白蛋白（α-La）。该研究最早在Bottomley的专利中描述了用截留分子量（MWCO）为100kDa 的超滤膜来获得富含α-La 的透过液，再用MWCO 为10kDa 的超滤膜来对透过液进行高倍浓缩，得到的浓缩液中α-La 的质量分数是β-Lg 的3 倍。Muller则用连续浓缩和连续渗滤的组合工艺得到了α-La 质量分数50%的WPC。孙颜君等采用微滤和超滤结合的方法制备得到WPC80，先用微滤降低乳清中的酪蛋白和脂肪，后通过超滤得到高α-La 浓度的WPC，所制得的WPC80 中α-La 的质量分数占总蛋白的64.37%。该研究发现要提取单独的α-La 主要的难点在于将α-La与分子量相近的β-Lg分离。

为进一步研究α-La 和β-Lg 的分离选择性，Cheang等采用α-La和β-Lg的二元混合物模型溶液，在pH 为5.5、总离子强度为50mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液中，以2～4m/s 的过滤速度通过MWCO为30kDa的复合再生纤维素膜，得到超滤选择性大于55。这是由于低pH和低离子强度下，基本不荷电的α-La透过率最高且β-Lg二聚体分子由膜孔径筛分作用可以很好地截留。紧接着，Cheang等进一步从WPI中分离α-La和β-Lg，得到的分离选择性为21，这比之前的55 要小得多。这是由于混合蛋白质溶液中蛋白质之间的不稳定造成了聚集。这说明从真实的乳清溶液中要分离单一的蛋白质，超滤的选择性仍有待提高。

为了提高蛋白的回收率和纯度，提高生产效率，将超滤与渗滤技术结合来回收乳清蛋白具有重要意义。渗滤可以克服高浓度料液透过率低的缺点，不断加水稀释有效降低了产品中乳糖和脂肪的含量。最初Muller 等研究了三种不同的工艺模式，即连续浓缩、间歇浓缩、连续浓缩-连续渗滤组合工艺。研究表明，连续浓缩-连续渗滤的组合工艺可以提高渗滤液中α-La 的纯度和产量，纯度50%、收率在80%以上。Almecija 等使用MWCO为300kDa 的管状陶瓷膜进行连续渗滤，探究了pH对分离乳清蛋白的影响，发现在pH为4～5时，α-La和β-Lg可以全部截留。在pH为3或9的条件下，乳清中牛血清白蛋白（BSA）和乳铁蛋白（LF）纯度提高了1.5倍，同样在pH为9的条件下，免疫球蛋白G（IgG）纯度提高1.6 倍。Baldasso等通过不连续渗滤来浓缩纯化乳清蛋白，所得浓缩蛋白的纯度大于70%，还发现少量多次添加渗滤水量时渗滤的效果更好。Cheang等研究了通过切相流过滤系统的渗滤过程分离α-La和β-Lg，最终β-Lg收率为90%，α-La的收率为70%。

虽然渗滤模式改善了超滤的分离性能，但是它加入大量去离子水稀释来去除杂质，很难在获得高纯度的同时达到高收率，即单级系统通常很难同时获得高的产率和纯度。Porter则首次提出多级（级联）超滤的概念，认为通过多个膜系统的优化连接可以改善膜分离性能。范丽娟等则采用两级超滤从牛初乳乳清中分离提取IgG，第二级超滤过程使第一级浓缩液中IgG纯度得到进一步提高，最终浓缩液中的IgG回收率为87.6%，IgG在总蛋白中的含量高达71%。Patil等使用三种不同的级联构型分离乳清蛋白，其中逆流级联系统无法同时得到高收率和高纯度，而调整后的级联构型和Lightfoot提出的理想级联构型都在回收率和纯度方面有更高的性能，纯度和回收率可同时达到80%。

总之，超滤技术是乳品行业中常见的操作单元，能够高效地从乳清中分离浓缩得到乳清蛋白。另外，采用渗滤以及级联超滤的方法可以进一步提高蛋白的收率和纯度，甚至可以获得一定纯度的单个功能活性蛋白。尽管超滤在乳清蛋白分离和纯化中的应用日益受到关注，但是目前超滤技术在蛋白分离中的应用也具有一定的局限性，主要体现在对某些目标分离蛋白的低选择性，难以分离分子量大小接近的蛋白质，以及浓差极化、膜污染问题导致通量下降等方面。

2.2 荷电膜超滤过程在乳清蛋白分离中的应用

在乳清加工过程中，虽然常利用超滤过程来制备WPC 和WPI，但是当制备单个功能活性蛋白，尤其蛋白间分子量大小接近时，仅靠超滤膜的孔径筛分作用，很难将目标蛋白有效地分离，获得的蛋白纯度也很低。有研究者指出，在乳清蛋白的分级分离过程中，只有当待分离目标蛋白与共存蛋白之间的分子量相差10 倍以上时，超滤过程才能将两者有效地分离。为了提高分子量接近的蛋白间的分离度，有研究者尝试采用荷电超滤膜，即借助蛋白质分子表面的电荷与超滤膜表面的电荷之间的静电作用，以提高超滤膜的选择性，从而实现分子量接近的蛋白间的分离。

乳清中α-La 和β-Lg 的相对分子量非常接近，仅凭超滤膜孔径大小的筛分作用很难将两者有效分离。但两者的等电点不同（表1），因此可通过调节溶液的pH，进而改变α-La 和β-Lg 的净电荷，从而使得二者和超滤膜间的静电作用力存在差别，以提高超滤膜对两种蛋白的选择性。如Cowan等对聚醚砜超滤膜改性，使膜表面或孔中荷负电，用这种改性后的荷电超滤膜分离α-La和β-Lg的二元混合物。当二元模拟混合体系的pH为7.2时，荷电聚醚砜膜的选择性比不荷电的原膜高5倍，从1.42提高到7.5 左右。该研究结果表明，荷负电的超滤膜与荷负电的β-Lg之间的静电排斥作用增强了β-Lg的截留率，从而使得超滤膜的选择性提高。Arunkumar等则在pH为4.3时使用MWCO为300kDa荷正电的复合再生纤维素膜，来分离α-La和β-Lg的二元混合物，其研究结果同样表明，与不荷电的复合再生纤维素膜相比，荷电超滤膜的选择性提高了近5倍，该研究进一步证明了荷电膜能够有效地提高α-La和β-Lg间的分离选择性。

上述研究中，虽然所使用荷电复合再生纤维素超滤膜的MWCO 比待截留的β-Lg 的分子量大15～20 倍，但借助于超滤膜与β-Lg 间的静电斥力作用，仍可保持高的β-Lg 截留率和高的选择性。此外，Arunkumar 等也尝试了从牛奶血清渗透液（MSP）中分离α-La和β-Lg。MSP相比乳清中包含更多的β-Lg，β-Lg会更容易在膜表面堆积，因此α-La必须要穿过更厚的β-Lg溶液层，才能透过膜面，在一定程度上增加了α-La 的传质阻力。但与不荷电的膜相比，荷正电的复合再生纤维素膜对MSP 中α-La 和β-Lg 的的选择性仍然提高了近两倍。此外，该研究中还使用了不同的级联构型来提高两种蛋白纯度。结果表明，使用相同的荷正电超滤膜构成的三级膜系统更为适宜，α-La和β-Lg的纯度分别可达87%和83%。即采用荷电膜进行级联超滤可达到和色谱分离相当的纯度，有望为α-La和β-Lg的分离提纯提供一种新方法。

除了将荷电超滤膜用于乳清中最难分离的α-La和β-Lg 间的分离提纯过程，也可用于分离其他乳清蛋白。如Vlino等使用MWCO为100kDa荷电膜对含有BSA 和LF 的二元混合物进行分离。当溶液pH 为5 时，BSA 不荷电而LF 荷正电，采用荷正电的膜可以使BSA 几乎全部透过膜而LF 完全截留，BSA 的通量可达30.2g/(m·h)，远高于Ndyaie所报道的通量2.0g/(m·h)。此外，也有研究者尝试从乳清蛋白中分离糖巨肽（GMP）。如Bhushan用荷正电的膜从β-Lg 和GMP 的二元混合物中分离出GMP，不荷电的GMP 渗透过膜，而荷正电的β-Lg受到超滤膜的排斥作用而截留。最终结果表明，使用荷电的膜比不荷电的膜选择性提高了6倍。紧接着作者还进行了放大实验，证明了荷电膜可以从真实的奶酪乳清中分离出GMP。值得一提的是，在乳清中添加盐会抵消掉膜荷电带来的选择性优势，但是通量会明显增大。也有研究者制备含有聚六亚甲基双胍制成的MWCO为1000kDa荷正电超滤膜用于乳清中GMP 的分离，与未荷电改性的超滤膜相比，其选择性提高了14倍。另外，在超滤膜材料不变的情况下对比一级超滤与三级超滤系统对奶酪乳清中GMP的分离效果发现，一级膜系统可得到纯度为90%的GMP，而三级膜系统则可将所分离的GMP的纯度提高至97%。该研究再次证明荷电超滤膜采用级联超滤的方法仍是获得高纯度和高收率的有效途径。此外，所制备的含有聚六亚甲基双胍制成的这种强荷正电膜可在电导率高达40S/m的乳清乳液中直接使用，无需额外添加清水稀释，即该方法可以直接从奶酪乳清中分离出色谱纯级的蛋白，这使得荷电膜超滤代替色谱法成为了可能，从而有利于乳清蛋白分离的大规模工业应用。

荷电膜不仅可用于单个目标蛋白的分离提纯，也可以用来浓缩乳清蛋白。如Arunkumar 等就研究了使用大孔径荷负电的再生纤维素膜浓缩乳清蛋白。将MWCO为100kDa的荷电膜与MWCO为10kDa的未荷电改性的超滤膜进行比较，结果表明，两种情况虽得到相同的蛋白质截留率，但MWCO 为100kDa 的荷电超滤膜的通量却比MWCO 为10kDa的未荷电改性的超滤膜的高出两倍。这是因为，荷负电的超滤膜与荷负电的蛋白质之间存在静电排斥作用。因此，使用大孔径的荷电超滤膜可以在保持高蛋白质截留率的同时获得更高的通量。此外，Arunkumar 等还测试了板式和卷式两种不同膜组件对超滤浓缩乳清蛋白的影响，发现使用两种不同构造的膜组件，乳清蛋白截留率均可达98%。

由上可知，将荷电超滤膜用于乳清蛋白的分离、浓缩工艺，与普通超滤过程相比，具有更高的选择性和渗透通量，蛋白质的收率也相应有所提高。荷电超滤膜不仅可用于乳清蛋白中主要的蛋白成分，如α-La和β-Lg等的分离，也可用于含量更少的蛋白，如LF和GMP等的分离过程。此外，荷电超滤膜的使用还可在一定程度上减少或避免膜污染的问题，增加了膜使用寿命的同时减少了运维费用，有利于进一步推动超滤膜技术在乳清蛋白分离与浓缩方面的工业应用。

3 电驱动膜在乳清蛋白分离中的应用

压力驱动膜以跨膜压力为驱动力，对于分子量大小相近的乳清蛋白，其选择性仍然有限，需要通过多级膜系统或与其他技术相结合才能达到理想的的收率和纯度。而电驱动膜以外加电场力为驱动力，借助于电泳迁移和孔径筛分的共同作用，可进一步提高目标蛋白的分离选择性。此外，压力驱动膜过程中，溶液中不同的蛋白质在外界压力的作用下容易沉积在膜表面或吸附堵塞膜孔；而电驱动膜分离过程中，电场力的存在会使得料液中部分荷相反电荷的大分子蛋白质背离超滤膜方向的迁移速度增加，膜面凝胶层减少或者消失，从而在一定程度上减轻了浓差极化和膜污染程度，有助于提高目标蛋白质溶液的渗透通量以及延长膜的使用寿命。因此，近年来电驱动膜技术在乳清蛋白分离中的应用引起了人们的关注。

3.1 电超滤过程在乳清蛋白分离中的应用

电超滤（EUF）是在传统膜过滤单元上叠加电场，通过蛋白质电泳迁移率的差异和膜孔径筛分作用来增强膜分离的选择性，是降低浓差极化提高渗透通量和产品纯度的有效方法之一。其有效性在果汁澄清以及浓缩和纯化蛋白质中已经得到证实。在采用EUF浓缩BSA溶液的实验中，Song等研究发现当施加电场时，目标蛋白质BSA 浓缩两倍所需要的时间比不施加电场减少了80%。这说明EUF在提高渗透通量的同时增大了BSA 蛋白的截留率，加快了蛋白质的浓缩，成为常规超滤浓缩乳清蛋白的可行替代工艺。另外，在EUF 中渗透通量随着电场、压力和错流速度的增加而增加，且pH 在蛋白等电点时可实现最大的分离度和更高的渗透通量。并且使用大孔径的超滤膜时，膜污染进一步减少，渗透通量更高。

在膜上施加外加电场不仅提高渗透通量，也是提高分离选择性和产品纯度的有效方法。例如在分离两个等电点不同的蛋白质过程中，适当调节pH可以使蛋白带不同的电荷，选择电场的极性就可使分子量较大的蛋白质分子向远离膜的方向移动，从而便于分子量较小的蛋白质分子跨膜迁移，获得更高的通量和纯度。用电微滤（EMF）分离乳清蛋白混合物中LF的实验中发现，在pH为7的中性条件下，LF 荷正电而β-Lg 和α-La 荷负电，当施加电场且阴极位于进料液一侧时，α-La和β-Lg跨膜迁移到渗透室，而LF向远离膜方向迁移被截留下来。LF 与两种主要乳清蛋白β-Lg 和α-La 的分离因子分别达到3.0和9.1。这说明电场的应用使分离选择性明显增强。另外，外加电场使膜的渗透通量增加了3倍，且膜污染的程度显著降低，该研究证明了EUF在奶酪乳清中的分离潜力。

影响EUF 性能的主要因素有两个方面。一是进料液的性质：蛋白的荷电性及荷电量、酸碱度、进料浓度、电导率和电泳迁移率。二是主要的工艺参数：跨膜压力、进料流速、电场强度和电流类型。这些因素需要相互调节以达到目标蛋白的分离或浓缩，同时减少膜表面的污染。例如EUF 应用于乳清蛋白分离时应确保被分离的蛋白质等电点明显不同，以保持蛋白质的电泳迁移率具有显著差异。同时还应注意待分离混合体系中盐离子的浓度，由于盐离子和蛋白质在外加电场的作用下，存在竞争迁移，过高的盐离子浓度会对EUF 分离蛋白过程产生不利影响，即荷电的蛋白质在低离子强度的溶液中具有更好的分离效果。另外，电极与溶液界面会发生电解反应，影响溶液pH，进而对蛋白分离选择性和收率造成负面影响。

此外，EUF过程中大多采用直流电场，但也有研究表明，交变电场或脉冲电场能明显引起凝胶层和膜孔中荷电粒子的震动，从而进一步减轻蛋白污染，提高膜的渗透通量，降低过程运行能耗。以乳清蛋白中BSA 配制的模拟溶液为研究对象，Zumbusch等发现，当施加交变电场时，BSA的渗透通量增加，且电场的影响在低频下更为明显。Oussedik 等发现利用脉冲电场进行EUF是降低膜阻力的有效方法，采用脉冲电场（=700V/m）可使渗透通量提高约300%。因此，不同的电场形式也为乳清中获得具有潜在应用价值的蛋白质组分提供了一种有效的方法。

3.2 电渗析/超滤耦合技术在乳清蛋白分离中的应用

电渗析/超滤耦合技术（EDUF）是一种分离荷电大分子物质的新型技术。用超滤膜代替部分离子交换膜，或在传统电渗析器的阴、阳离子交换膜间引入超滤膜，从而将电渗析和超滤过程有机结合而成的一种膜过程。EDUF将电渗析的应用领域扩展到了生物分子，如聚氨基酸、肽或蛋白质等的分离和浓缩领域。该技术主要根据物质分子量和电荷的不同来进行分离。最基础的EDUF 构型是在传统电渗析器的阴、阳离子交换膜之间引入一张超滤膜，从而构成的四隔室结构（图3）。其中进料室位于阳极一侧，进料液中的阳离子组分透过超滤膜迁移到回收室。EDUF中唯一的驱动力是垂直于流体流动方向的电场力，每种物质的荷电性不同，荷质比不同，则电泳迁移率亦不同，进而导致迁移速度和迁移方向各不相同，而达到分离的目的。EDUF 与传统超滤过程相比，具有更高的选择性，能够有效减轻压力驱动超滤膜过程的的膜污染问题。此外，电渗析过程中发生的脱盐作用使得它更适用于从高电导率的进料溶液中分离蛋白质。

图3 EDUF膜对结构

EDUF 的操作模式一般分为分离模式和洗脱模式两种（图4）。在分离模式下，两个隔室分别加入含有两种溶质A 和B 的混合溶液。在洗脱模式下，其中一个隔室包含A和B的混合溶液，另一个隔室则加入缓冲溶液。Galier 等研究了分离和洗脱两种操作模式，以分离α-La 和牛血红蛋白。当α-La 和牛血红蛋白的二元混合模型溶液的初始浓度为0.1g/L 时，在洗脱模式下获得的浓缩α-La 纯度99.0%，收率66%，而在分离模式下α-La 纯度60%，收率84%。很明显，分离模式的蛋白收率是洗脱模式收率的1.3 倍，这表明就生产而言，分离模式可以达到更高的收率，并且对于分离相反电荷的蛋白质更可取。相反，为了分离纯度更高，洗脱模式则是首选，特别是对于分离荷同种电荷的蛋白质。

图4 EDUF的两种模式

除此之外，其他研究者也验证了EDUF在分离单个乳清蛋白方面的可行性。Ndiaye 等使用EDUF 体系从乳清中分离出了LF。当使用MWCO为500kDa的聚醚砜超滤膜从pH 为3.0、LF 含量为1g/L 的稀溶液中分离LF 时，过程运行4h后的收率达到46%。但当从LF 含量较高（1.1g/L±0.2g/L）的模拟乳清溶液中分离LF，LF 的收率则只有15%，明显低于稀溶液时的迁移率。这可能是由于LF 与乳清中其他共存的蛋白间存在相互作用、相互竞争的关系，也有可能是因为乳清中所含的小分子矿物质首先迁移，从而降低了LF的电泳迁移率。更重要的是，在该研究中还发现，β-Lg 在每一种实验条件下，透过液中所占的比例都很高。尤其是在pH为3.0和4.0时，透过液中β-Lg的含量占总迁移蛋白的60%～64%。这个含量比之前采用压力驱动或者离子交换工艺得到的β-Lg 含量都要高，且过程的比能耗最低。该研究证明了EDUF从乳清中分离β-Lg 的潜力。Wang 等研究了用EDUF 将LF和IgG与其他乳清蛋白分离，且在分离过程中使用一对限制膜来防止回收的LF 和IgG 泄露到电极溶液中。而Deng 等则比较了不荷电的聚丙烯酰胺膜和阴、阳离子交换膜分别作为电极限制膜时过程的分离性能。发现使用聚丙烯酰胺膜可以保持料液环境稳定，进料室和透过室的pH 变化很小；以阳离子交换膜作为限制膜的EDUF构型可获得最高的蛋白质回收率，而当分离带有净正电荷的蛋白质时，则最好使用阴离子交换膜作为限制膜，以减小膜面蛋白吸附污染。

EDUF 分离过程的选择性可以通过调整缓冲溶液组成及pH、膜孔径等来提高。根据分离目的以及分离模式的不同，EDUF分离体系中的超滤膜平均孔径可以选择大于目标蛋白大小，以截留混合物中的其他大分子物质，而使得目标蛋白顺利透过超滤膜；也可以选择小于目标蛋白大小的膜孔径，以允许更小的物质通过，目标蛋白被截留而实现蛋白的浓缩和纯化过程。此外，当溶液的pH 大于蛋白质等电点时，蛋白带负电，而溶液的pH 小于等电点时，蛋白则带正电。因此，在外加电场的作用下，可通过调整缓冲溶液组成及pH，使得待分离的目标蛋白与其他共存蛋白荷有不同性质的电荷，继而在电泳迁移和孔径筛分的双重作用下，实现目标蛋白的分离和浓缩。如Gailer 等曾报道，在EDUF分离蛋白过程中，过程的选择性主要是基于溶液中不同物质传质速率的差异，而这种差异可能是由于电泳迁移率的差异（基于电荷模式），也可能是由于膜孔和溶质的大小不同而产生的尺寸排斥效应（基于尺寸的模式），或是两者的组合（基于电荷和基于尺寸的模式）。在尝试利用EDUF 过程分离α-La和β-Lg的实验中，曾讨论了电荷模式和尺寸模式两种方法分离两种蛋白的可行性。最终研究发现，改变溶液的pH 比改变膜孔孔径对提高α-La的收率更为有效，使用MWCO为100kDa的醋酸纤维素膜、pH 为4.8 时，获得了更高的分离效率，二者的分离系数为1.2。另外，在分离α-La和牛血红蛋白的研究中则发现，在不影响纯度和产品收率的情况下，增加进料的浓度可以至少将产量提高5 倍。而不同的膜材料也对蛋白迁移有影响，Wang采用的相转化法制备的聚丙烯醇膜对LF 和IgG有强排斥性，则允许乳清中其他蛋白质以高通量通过。

3.3 EDUF分离乳清蛋白活性肽的应用

将乳清蛋白进一步水解，分离出其中具有特定价值的活性肽是乳清蛋白资源化利用的另一种方法。乳清蛋白是大分子蛋白，在人体中水解成短肽和游离氨基酸后方可被吸收，且对热、酸敏感，易变性。研究发现，乳清蛋白通过酶解或发酵等方法可以获得多种具有独特理化性质的生物活性肽。活性肽相对分子量小，可被人体快速吸收。目前，人们已经从乳清蛋白水解液中提取了诸如抗菌肽、降血压肽、抗氧化肽等活性肽。

近年来一些研究显示采用EDUF可以成功从食品副产品中分离不同来源的肽，该技术不仅已用于分离和纯化大豆、亚麻籽、鱼、雪蟹、苜蓿或乳清蛋白水解物，而且还用于分离脱乙酰壳多糖低聚物、烟草多酚、绿茶儿茶素或蔓越莓果汁中抗氧化剂的富集等。对于乳清中的β-Lg，用胰蛋白酶水解后的产物中大约含有40 个肽。Poulin 等通过EDUF 成功地从β-Lg 的胰蛋白酶水解产物中分离出了13 种多肽。用两或三张超滤膜可实现同时分离阳离子和阴离子活性肽，其中可以用于抗高血压的ACE抑制肽β-lg142-148的收率最高，为10.72%。另外，超滤膜的引入方式、电场强度和进料溶液流速对目标肽分离性能的影响研究结果表明，有效膜面积的增加和电场强度的提高可使目标肽浓度增加。相反，料液流速对总肽向透过液中的迁移没有太大影响，但会引起选择性的变化。Doyen 等实现了在一个电渗析装置中同时进行β-Lg 的酶促水解和水解产物的分离。成功分离出15个阴离子肽和4个阳离子肽。另外，蛋白质水解前的预处理、使用不同的酶来酶解蛋白、蛋白质本身的水解都会影响EDUF过程中对活性肽的分离。如沈浥等研究发现，胰蛋白酶酶解的效果最好，而相比单酶酶解，复合酶酶解不仅可以提高乳清蛋白模拟溶液的酶解效率，在一定程度上还可以修饰苦味肽，减少产品苦味。

超滤膜的理化性质对EDUF分离活性肽有显著的影响。Bazient 课题组发现在滤膜的九种理化性质对比中，zeta电位、电导率、粗糙度和过滤层大孔分布百分比四个性质对肽的整体迁移显著相关。此外对个别单肽而言，接触角也有相当大的影响。同时根据冗余分析发现，zeta 电位和粗糙度是肽污染的主要因素，表明肽的污染主要是由粗糙的膜表面与活性肽间的静电相互作用造成的。另外采用MWCO分别为30kDa和50kDa聚醚砜膜对比发现，膜孔径不影响肽的污染，而相同条件下聚偏氟乙烯膜和聚丙烯腈膜显示，当膜孔径增大时，肽的污染减少，且无论肽的亲水性如何，疏水性的膜总是比亲水性膜的污染程度更大。此外，在Kadel的结论中最后给出了分离各种乳清蛋白水解物中主要活性肽的滤膜最佳类型。例如分离降胆固醇肽IDALNENK 最好是采用分子量5kDa 的聚醚砜膜，这为其后的研究工作提供了极大的便利和有益参考。

4 乳清蛋白分离中的膜污染及其控制

在膜分离过程中，膜污染和浓差极化现象是造成膜通量下降的主要原因。同时蛋白的流失也制约着膜技术在乳清蛋白回收中的推广应用。Muller等研究发现随着跨膜压力的升高，膜污染加重，导致通量下降，透过的α-La浓度减小，降低了α-La的收率。孙颜君等表明乳清中含有磷酸钙，它起到稳定乳清蛋白结构的作用。由于磷酸钙分子量较小，很容易透过膜孔径与蛋白分离，当磷酸钙失去了蛋白保护层，容易在膜表面和膜孔中形成沉淀。另外，乳清蛋白聚集体的形成也是超滤过程中造成膜污染的原因，这种现象是由于蛋白质-蛋白质和蛋白质-膜的相互作用力造成的。在乳清蛋白分离的膜过程中，pH 和盐离子的变化均会影响蛋白质的构象和电荷的变化，从而聚集沉积在膜表面使污染加剧。因此，通过调节超滤过程中的操作参数，如料液组成和浓度、pH、温度、离子强度以及跨膜压力等可以改善膜污染问题。研究显示，在蛋白质等电点条件下膜污染严重且通量最小，当pH 远离等电点时通量增加，这主要是由于蛋白质在等电点处溶解度最小，容易沉积在膜表面。此外，较低的跨膜压力、略高的温度、低离子强度都能在一定程度上减少膜污染。另外考虑到乳清蛋白是一种复杂的混合蛋白，针对不同目标蛋白的不同性质，对应的最适操作条件也不同。

除此之外，也有研究者发现，乳清中的α-La、β-Lg以及活性肽等与大分子蛋白IgG相比，更容易在膜表面发生沉积以及堵塞在膜孔中导致膜污染。研究证实，与小尺寸蛋白质相比，大尺寸蛋白质对膜的影响较小，也更容易清洁。因此在超滤浓缩乳清蛋白的过程中增加蛋白质尺寸也可以减少膜污染，同时增加膜通量和乳清蛋白回收率。其中，酶催化使蛋白质聚合，可以增大蛋白质整体大小，产生的酶聚合蛋白同样具有一定的功能特性可应用于食品和化工领域。王文琼等采用酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合，聚合后的大分子蛋白在膜表面形成疏松的饼层，增加了小分子蛋白的截留，酶处理后滤饼阻力和膜总阻力显著性降低。相对于没有通过酶聚合处理的对照组，膜通量提高了20%，乳清蛋白的截留率提高了27%。另外，采用转谷氨酰胺酶催化交联蛋白质时，膜通量提高了30%～40%，截留率则提高了15%～20%。该研究结果表明，不同酶催化蛋白得到的蛋白形状、表面电荷、形成的饼层都不相同，得到的通量和蛋白收率也不同。据文献报道，在能够交联蛋白质的各种酶中，转谷氨酰胺酶是最有效的，因为它可以通过形成分子内和分子间交联来催化α-La、β-Lg，甚至酪蛋白巨肽，从而形成高分子聚合物。

酶催化蛋白聚合可以减少膜污染的另一个原因是溶液中微粒的粒径和形状对膜过滤效果的影响。研究表明，当滤液中的物质为方块或者针形，过滤的速率会大大增加，而当滤液中的物质为圆形时，过滤速率会减小。这主要是因为方形和针形两种形状所形成的饼层可以增加过滤速度。由于乳清蛋白中的α-La和β-Lg为球形蛋白，因此在蛋白聚合酶的作用下聚合形成不规则形状，在膜表面形成疏松的饼层，增加了过滤的速度，膜通量增加。

调节膜与蛋白之间的相互作用也是减轻膜污染和浓差极化的方式之一，采用新型的膜材料或者改善现有膜材料的亲疏水性、荷电性等方式增大对溶质分子的排斥力，以减少膜表面蛋白沉积。例如，当蛋白质表面的静电荷和膜表面的电荷之间的电性相反时，膜与蛋白间的静电吸引作用将会促进蛋白质在膜表面的吸附，吸附蛋白也有可能在膜上发生变性和聚集。而当膜与蛋白间存在静电排斥作用时，将会有效减轻或避免蛋白在膜面的吸附。另外，膜材料的亲、疏水性也会影响膜通量的大小。如聚砜膜是疏水性膜材料，疏水性膜对蛋白的吸附能力比较强，蛋白质会在膜表面沉积或吸附到膜孔中而导致膜孔阻塞通量下降，这与Damar 等实验中得到的结论相同。一般认为，在超滤过程中，亲水性的膜对乳清蛋白具有较高的渗透通量和较低的通量衰减率；且亲水性的膜清洗后膜通量的恢复通常更快。当然，目前很多改性的新型超疏水复合膜对蛋白同样具有高的膜通量和截留率，且同时兼具良好的抗污能力。除此之外，膜的粗糙度对蛋白的跨膜迁移也有影响，高粗糙度的膜增加了蛋白和乳糖的截留率

目前，无机陶瓷膜由于耐高温、耐腐蚀、抗污染强等优点也逐渐用于乳清蛋白膜回收的研究中。在Erdem等、Almcijam 等、Hinkocva 等的实验中陶瓷膜展现了较高的蛋白截留率。但就总体来看，在乳清蛋白回收领域主要还是采用价格低廉、技术成熟的高分子聚合膜。常见的膜材料，例如再生纤维素膜对乳清蛋白有更高的浓缩效果，有较高的抗污染性能，但是它的选择性较差。同时，在分离α-La和β-Lg的实验中发现，复合再生纤维素膜对α-La的截留率更高，而聚醚砜膜对β-Lg的截留率较高。此外，聚醚砜膜用于制备乳清蛋白粉效果更好，有明显的耐氯性。总而言之，具有亲水性、表面光滑、孔隙率高、粗糙度低、孔结构呈海绵状结构的膜材料最适合分离浓缩乳清蛋白，因为它具有较强的抗污染能力、高的截留率和高通量。

由于蛋白质和超滤膜间相互作用的复杂性，目前膜污染仍然是膜技术应用于乳清蛋白分离浓缩方面的主要挑战。有研究者建立了不同的数学模型用于预测膜污染过程中膜通量随时间的变化规律，其中完全堵塞、中间堵塞、标准堵塞、滤饼形成等模型通常都被用来分析蛋白质过滤中的通量衰减问题。例如Corbatón-Báguena 等结合两种主要污染机制（完全孔隙堵塞和滤饼形成）构建组合模型，所构建模型的拟合精度高于0.960。也有研究者借助新技术对膜污染的形成过程进行监测，如采用红外光谱、紫外/可见反射光谱监测法、共聚焦激光扫描显微镜、荧光光谱、流动电势、超声波时域反射仪等先进分析仪器，检测乳清的超滤过程中膜污染的形成机制，探讨蛋白质-蛋白质、蛋白质-膜之间的相互作用机理，为有效控制膜污染提供理论依据。

5 结语

乳品行业乳清废水的排放造成了大量的蛋白资源浪费和水资源浪费，加重了环境保护的难度。因此，将乳清中的蛋白进行资源化回收利用具有极大的环境意义和经济效益。乳清蛋白的高营养和功能特性使其在食品和制药领域具有广阔的应用前景和市场潜力。随着乳清蛋白分离技术产业化的实现，将会提高乳清蛋白产品性价比，降低市场中功能性食品或保健品的原料成本，获得极大的经济效益。本文总结了众多学者在探索乳清蛋白分级分离方面取得的大量研究成果。目前超滤技术已广泛用于工业化制备乳清蛋白粉等产品，且电驱动膜分离技术EUF以及EDUF工艺体现了良好的分离效果。探索出低成本、高选择性、高纯度、高收率、可工业化实施的膜分离方法是未来的主要发展方向。另外还需要从以下几个方面进行深入的理论研究与工艺开发。

（1）目前还少有研究从乳清中分离提取得到纯度较高的单个α-La或β-Lg产品。因此需要积极探索开发新型膜材料、模组件和工艺设计等，进一步提高两者的分离效率。

（2）荷电超滤膜技术与EDUF技术都极大地提高了过程的分离选择性，因此将荷电超滤膜结合EDUF 技术具有重要意义。可以进一步研究EDUF工艺中超滤膜不同的荷电性、荷电量对乳清中蛋白质分离的影响。

（3）对于EUF和EDUF技术，其应用到实践中还存在很多技术上和商业化的难题，需要通过进一步研究评估其技术和经济可行性。

（4）分离纯化后的浓缩干燥工艺，也是实现功能性乳清蛋白产业化的重要部分，需要进一步研究如何保持纯化后蛋白质一定的生物活性及其特有结构，以便发挥其功能特性。