细胞因子IL-17A对成牙骨质细胞增殖、分化及矿化影响的实验研究

胡熹，罗俊

（1.南昌大学第二附属医院口腔科，南昌330000；2.南昌大学附属口腔医院正畸科江西省口腔生物医学重点实验室江西省口腔疾病临床研究中心，南昌330000）

牙根吸收是临床正畸治疗过程中一种常见的并发症[1-2]，近年来已成为正畸医生关注的热点问题之一。有学者对牙根吸收的诸多因素进行归纳，包括性别、年龄、牙齿的移动方式、牙髓活力、牙根长度和牙冠的根冠比，牙槽骨的皮质厚度等[3-6]；也有学者对牙根吸收相关的分子学进行了大量的基础实验研究，如:Th1、Th2相关细胞因子（TNF-α,IL-6，GM-CSF）以及其他细胞因子(骨保护素、整合素αvβ3、一氧化氮、各种蛋白酶等)的研究[7-8]。白介素17（IL-17）家族是一组由辅助性T细胞产生的促炎性细胞因子。 IL-17家族成员不仅参与组织的免疫反应，而且还参与骨代谢。尽管已有广泛研究IL-17在破骨细胞介导的骨吸收中的作用[9]，但很少研究其在成骨细胞介导的骨形成中的作用。本研究拟观察IL-17A对成牙骨质细胞OCCM30增殖、分化及矿化的影响；探讨IL-17A对正畸力致牙根吸收骨代谢过程中的调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 白介素17（美国Peprotech公司），成牙骨质细胞株OCCM-30（四川大学赠送），CO2恒温培养箱，酶联免疫检测仪，离心机，倒置光学显微镜，MTT粉剂（Amresco公司），茜素红，DMEM/F12（Hyclone，美国)，胎牛血清(FBS，Hyclone，美国)，胰酶-EDTA消化液（Solarbio公司），二甲基亚砜(DMSO，Solarbio公司），β-膦酸甘油，哺乳动物蛋白抽提试剂（康为世纪），西砒氯铵。

1.2 实验方法

1.2.1 OCCM-30的培养 将OCCM-30按1×105个/瓶培养于50 mL细胞培养瓶，加入含10%FBS的DMEM/F12培养液，置于CO2恒温培养箱(37℃，5%CO2，95%空气)中培养，每天换液。倒置显微镜下观察细胞铺满培养瓶底80%时即可开始按1∶3传代，传代后置于恒温培养箱中培养，每天换液。

1.2.2 不同浓度IL-17A对OCCM-30增殖的影响采用噻唑蓝比色试验。取对数生长期细胞，制备密度为1×104/mL OCCM-30单细胞悬液，接种于96孔板，对照组和IL-17A组共计6组，每组6复孔。观察细胞贴壁后，弃去培养液及未贴壁细胞，实验组分别用含10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL IL-17A的培养液处理细胞，对照组使用不含IL-17A的完全培养液，继续培养3 d，进行MTT分析。每孔加入20μL 5.0 mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4 h，加入150μL的DMSO，低速振荡15 min，设立空白对照孔(不含细胞)以进行调零，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测其吸光度(optical density，OD值)。

1.2.3 不同浓度IL-17A作用下OCCM-30内ALP活性检测 将OCCM-30细胞以2×104/mL接种于96孔培养板，对照组和IL-17A组共计6组，每组6复孔，置于CO2孵箱内培养6 h，倒置显微镜观察细胞贴壁后，弃去培养液及未贴壁细胞，对照组加含10%FBS的DMEM/F12，IL-17A组中分别加入含10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL IL-17A的培养基,继续培养48 h，弃去培养液，每孔加入哺乳动物蛋白抽提试剂100μL，冰上孵育20 min，并用枪头吹打贴壁细胞，将裂解液转移至EP离心管中，14,000 rpm离心20 min，取上清50 μL种于96孔培养板中，用ALP试剂盒做酶联免疫吸附试验（Elisa）。

1.2.4 不同浓度IL-17A作用下OCCM-30形成矿化结节含量测定 采用茜素红染色法。将细胞消化计数，按每孔5×104个/mL细胞浓度接种于24孔板，每孔500μL，每种浓度重复6孔，对照组加入矿化培养基DMEM/F12（含10%FBS、抗坏血酸50 μg/mL、10 mmol/L B-磷酸甘油钠），IL-17A组中分别加入含10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL IL-17A矿化培养基。7 d后可见矿化结节形成吸去培养液，PBS冲洗，用4%多聚甲醛原位固定10 min，0.1%茜素红（0.1 g茜素红，溶于0.1 M的tris-Hcl 100 mL中，调节PH为8.3）染色30 min，吸去染液，用PBS洗去浮色，加入10%西砒氯铵，室温放置20 min，用酶标仪在570 nm处测定OD值。

2 结果

2.1 不同浓度IL-17A对OCCM-30增殖的抑制作用IL-17A作用OCCM-30细胞24 h后，不同浓度的药物干扰实验组OCCM-30细胞活力与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。而在IL-17A作用48 h和72 h后，OCCM-30细胞活力呈浓度依赖性地降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

结果显示，IL-17A对OCCM-30细胞增殖的抑制作用随时间的延长而增加，细胞毒性呈时间和浓度剂量反应关系，见表1、2。

表1 不同浓度IL-17A作用下OCCM-30吸光度值

2.2 Elisa定量检测碱性磷酸酶（ALP）活性结果显示 不同浓度IL-17A作用于OCCM-30 48 h后，实验组ALP活性较对照组显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），结果表明，IL-17A浓度为10 ng/mL至30 ng/mL成梯度降低，30 ng/mL以上ALP活性维持较低水平。

2.3 不同浓度IL-17A作用下OCCM-30形成矿化结节含量测定 OCCM-30贴壁后呈对数增长，待细胞长满后聚集成灶（图1），分泌骨基质矿化，形成矿化结节(图2、图3)。由图3所示，与对照组相比，不同浓度IL-17A作用于OCCM-30形成矿化结节呈现浓度依赖性降低。浓度为30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL的IL-17A明显抑制矿化结节的生成，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图1 成牙骨质细胞occm-30贴壁后4 d

图2 典型矿化结节染色

图3 矿化结节聚集成灶

表2 不同浓度IL-17A作用于OCCM-30细胞48 h后ALP活力改变

3 讨论

牙根吸收是临床正畸治疗过程中常见的并发症之一，有学者认为几乎所有的正畸患者都存在某种程度的牙根吸收，其发生率在3%～100%[10]。破牙骨质细胞是负责牙齿硬组织吸收的多核细胞，在形态和功能上均与破骨细胞相似。破骨细胞是正常骨结构的一部分，在生理条件下，破牙骨质细胞在牙骨质或牙根表面很少见[11]。它们存在于根吸收表面。牙根吸收是一个非常复杂的过程，主要作用细胞为破骨细胞和破牙骨质细胞。而成牙骨质细胞具有抗吸收特性，在抵御外界刺激、防止牙根外吸收的过程中发挥着重要作用[12]。

3.1 Th17细胞及其相关细胞因子IL-17A的研究在正畸力作用下，龈沟液内各种细胞因子参与了细胞内牙周组织改建[13-14]。在骨吸收过程中，T细胞对成骨细胞和破骨细胞有刺激和抑制作用，它可通过产生正负调节因子而影响骨代谢，这种作用与T细胞亚群、细胞因子的类别和局部因素密切相关。

Th17细胞是CD4+T细胞亚群，它的发现起源于实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和胶原诱导的关节炎(CIA)的研究。Thl7细胞产生的细胞因子主要有IL-17A(IL-17)和IL-17F、IL-22；这些细胞因子广泛参与全身免疫系统性疾病的调节。IL-17A是IL-17家族(IL-17A-F)中的重要成员，也是Th17的记忆T细胞亚群主要的细胞因子[15]。

3.2 IL-17A在正畸力致牙根吸收中作用的可能性机制 牙骨质缺损是炎症性外吸收发生的前提，体外研究发现，牙骨质细胞也可表达骨保护蛋白（OPG）和核因子-KB受体活化因子配体（RANKL）mRNA，且相对于骨细胞，其OPG的表达量更高，而RANKL的表达量更低，使得表达的OPG/RANKL比例较高，牙周膜细胞可以通过调节OPG-RANKL-RANK轴来影响成牙骨质细胞的形成[16]。有学者建立了类风湿病关节病动物模型，发现IL-17A不仅可抑制成骨细胞的增殖、分化，还可增加小鼠颅顶成骨细胞中RANKL的表达[17]。本实验结果显示，IL-17A能显著抑制体外培养OCCM-30的增殖，并且具有高度依赖性。在24 h时药物对OCCM-30增殖无明显影响，从48 h开始出现抑制作用，并呈时间依赖性。本实验中，不同浓度的IL-17A作用于OCCM-30细胞48 h后，其ALP活性有显著差异，差异有统计学意义。

本实验结果显示，IL-17A在浓度为30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL时明显抑制矿化结节的生成，且形成矿化结节量无明显变化。成骨细胞需要28天左右形成明显矿化结节，而本实验中，OCCM-30仅需7 d即形成明显矿化结节。成牙骨质细胞迅速矿化的原因可能是细胞内外骨涎蛋白、OCN等矿化相关蛋白表达强烈，而成骨细胞表达的相关矿化蛋白相对微量。IL-17对成骨细胞分化的调节也能起到影响骨矿化的作用，通过促进成熟成骨细胞分化，从而为细胞矿化提供有利条件[18]。

综上所述，IL-17A抑制成牙骨质细胞增殖、分化及矿化，本实验在细胞水平上探讨IL-17A是否参与了正畸性牙根吸收，为IL-17A影响牙根吸收提供部分实验基础。