海红米米糠对慢性应激诱导小鼠抑郁样行为和异常肠道微生物及神经递质的改善作用

李晓红， Rabia Parveen， 杨志友， 张永平，周鸿凯， 刘文超， 苏伟明， 宋 采

(广东海洋大学食品科技学院1，湛江 524088)(广东省水产品加工与安全重点实验室2，湛江 524088)(广东海洋大学滨海农业学院3，湛江 524088)(广东海洋大学深圳研究院4，深圳 518120)

抑郁症是一种严重危害精神和生活质量的常见疾病，是世界范围内疾病总负担排名第3位的疾病。但是发病机制复杂且治疗效果不佳，缺乏治疗效果好且副作用小的抗抑郁药物。近几年“微生物-肠-脑轴”假说的提出为解决这一问题提供了一条新途径和新方法。学者们认为肠道微生物与中枢神经系统存在双向沟通[1]，如应激可导致肠道菌群失衡，结肠微生物组成发生变化[2]，进而导致“微生物—肠—脑轴”功能紊乱。研究发现肠道微生物在抑郁症患者和健康人群中存在明显差异，在抑郁症患者中发现梭菌属和大肠杆菌的数量增加[3]，而双岐杆菌属和乳酸杆菌属的数量下降[4]。实验进一步证明双岐杆菌可以减少母婴分离的老鼠出现抑郁症状，可以改变老鼠体内单胺类神经递质的水平[5]具有类似抗抑郁剂的作用。因此，以改善肠道微生物作为核心来调整大脑为靶向的干预方法来预防和治疗抑郁症等神经精神性疾病具有重要意义及应用前景。

我国是世界上最大的稻米生产国，为稻谷碾白副产物米糠约占稻谷的12%，米糠资源十分丰富，但利用率极低[6]。海水稻是生长于海边滩涂的一种耐盐碱水稻新品种，其稻米外皮呈紫红色，故也称海红米，素有“药米”之美誉。研究发现海红米的营养成分主要集中在米糠中，如膳食纤维、蛋白质、维生素、多糖、脂肪酸、植酸和矿物质等功能性成分[7]，且多种营养物质含量都远高于白米米糠[8, 9]；除此之外海红米米糠比白米米糠含有更丰富的黄酮、阿魏酸、γ-氨基丁酸、六磷酸肌醇和生物碱等活性物质[10, 11]，因而具有调控肠道微生物组成、发挥益生元功效、增强抗应激反应、调节神经递质功能和抗炎等生理功能[12-14]，但在精神类疾病如抑郁症中鲜见报道。本研究采用国际公认的慢性不可预测温和应激(CUMS)诱导抑郁症动物模型，通过检测小鼠的糖水偏好度和悬尾实验的行为、肠道微生物、前额皮层中单胺类神经递质的含量来评价海红米米糠在小鼠抑郁症模型中的作用，为海红米米糠在改善和治疗神经精神类疾病的保健品或药物开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

平均体重为25 g无特定病原体(SPF级)雄性成年C57BL/6种小鼠42只，(NO.1103222011 005888)。饲养于SPF级动物房(许可证号 SYXK(粤)2014-0053)，温度(23±1) ℃，湿度(50±10)%，12 h光照(7:00-19:00)，自由摄食和饮水，实验动物的饲养和操作规程均遵守实验动物饲养和使用的相关规定，并通过实验动物伦理审查(广东海洋大学 IACUC-20200721-036)。海红米米糠(国家耐盐碱水稻技术创新中心华南中心)，QIAamp DNA Stool Mini Kit，荧光定量PCR仪，神经递质标准品，高效液相色谱，SYBR Green荧光染料，Taq DNA聚合酶，琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与处理

将42只小鼠常规喂养7 d后随机分为4组：对照组(CT，n=11)、应激组(CUMS，n=11)、海红米米糠组(R，n=10)和应激+海红米米糠组(CUMS+R，n=10)。海红米米糠按照张瑛等[15]方法获得，按5%质量比的海红米米糠均匀添加到粉末基础饲料(配方如表1)中，充分均匀。小鼠自由摄取食物，参考Drescher等[16]给予每只小鼠6 g/d混合饲料或基础饲料。

表1 小鼠基础饲料配方

1.2.2 抑郁动物模型的建立

采用本实验室[17]CUMS模型建立的方法。应激源的设置：200 r/min摇床1.5 h，缺水并空水瓶过夜，缺食过夜，湿垫料过夜，束缚1.5 h，18 ℃游泳10 min，鼠笼倾斜45°过夜，异味过夜，单笼过夜，频闪灯过夜，光照过夜，4 ℃环境1.5 h，拥挤3 h。每天随机给予2种不同的应激源刺激，且3 d内不重复，应激周期为63 d。动物处死后，将肠道表面消毒后，迅速分离结肠中的粪便，装入无菌EP管保存。剥离全脑，在冰上快速分离出前额叶皮质组织，均快速置于-80 ℃保存。具体实验流程如图1所示。

图1 具体实验流程图

1.2.3 糖水偏好实验

前期已报道小鼠的快感缺乏程度可以采用糖水偏好度来评价，糖水偏好度越低说明抑郁程度越深，具体操作按照Li 等[18]的方法。

1.2.4 悬尾行为学实验

小鼠在悬尾实验中，为了克服不正常体位而企图逃脱但又逃脱不了，从而放弃挣扎，该状态称为“绝望状态”。具体操作按照Gu等[19]的方法，记录小鼠在5 min 内放弃身体挣扎的总时长。

1.2.5 实时荧光定量PCR

使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒从小鼠结肠内容物中提取微生物DNA。具体操作步骤参照刘涛[20]的方法。

标准曲线：以拷贝数的对数值为横坐标，PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数(Ct)为纵坐标绘制标准曲线。乳杆菌的标准曲线方程为y=-2.800 7x+42.679，R2=0.989 4；双歧杆菌的标准曲线方程为y=-3.685 4x+48.732，R2=0.989 4；梭菌的标准曲线方程为y=-3.738 7x+45.494，R2=0.995 1；大肠杆菌的标准曲线方程为y=-3.472 6x+46.17，R2=0.988 7。相关系数均达到了0.95上，可以作为日后检测的标准。

表2 qPCR引物序列[21, 22]

1.2.6 小鼠前额叶皮质中单胺类神经递质的提取及测定

前额叶皮质是情感整合和认知的高级中枢，负责执行认知过程的加工，参与控制情绪及冲突行为。按照本实验室方法[18]进行神经递质的提取及测定。

1.2.7 数据处理

2 结果与分析

2.1 海红米米糠对应激诱导小鼠快感缺乏的改善作用

与对照组相比，慢性应激可显著增加小鼠的快感缺乏程度(P<0.01)；而相比应激组，同时喂食海红米米糠组可逆转应激诱导小鼠的快感缺乏行为(P<0.01)，表明海红米米糠对应激诱导小鼠的快感缺乏有逆转作用。

2.2 海红米米糠逆转应激诱导的小鼠绝望放弃行为

与对照组相比，慢性应激可极显著增加小鼠的绝望放弃行为(P<0.001)。而给予海红米米糠干预后，可显著逆转应激诱导小鼠的绝望放弃行为(P<0.001)，这表明海红米米糠对应激诱导小鼠的绝望放弃行为有逆转作用。

2.3 海红米米糠对应激诱导的小鼠结肠微生物数量的影响

如表3所示，与对照组相比，慢性应激显著降低小鼠结肠中乳杆菌(P<0.01)和双歧杆菌的数量(P<0.01) ，显著升高梭菌(P<0.05)的数量，对大肠杆菌的数量没有影响；而相比应激组，同时喂食海红米米糠组小鼠结肠中乳杆菌和双歧杆菌的数量(P<0.01)显著增加，而对梭菌的数量有减少的趋势。因此，海红米米糠对应激诱导小鼠肠道菌群的失衡有改善作用。

表3 小鼠肠道微生物的数量变化

2.4 海红米米糠对应激诱导的小鼠前额叶皮质中单胺类神经递质含量变化的影响

由表4～表6可知，与对照组相比，应激组小鼠前额叶皮质中的NE(P<0.01)、5-HT(P<0.05)、DA(P<0.05)及其代谢产物MHPG(P<0.01) 、5-HIAA(P<0.01)、DOPAC(P<0.01)的含量均显著下降，而DA/ DOPAC比值显著上升。而与应激组相比，喂食海红米米糠组小鼠前额叶皮质中的NE(P<0.05)、MHPG(P<0.05)和5-HT(P<0.05)的含量显著上升。说明海红米米糠对应激诱导的小鼠前额叶皮质中单胺类神经递质的功能紊乱有改善作用。

表4 去甲肾上腺素和其代谢产物及比值的变化或6)

表5 五羟色胺和其代谢产物及比值的变化

表6 多巴胺和其代谢产物及比值的变化

3 讨论

临床研究表明持续性的慢性应激是引发抑郁症的主要诱因。我们和其他学者的研究显示给予动物慢性持续性应激刺激，表现出明显的糖水偏好度降低、焦虑，以及产生绝望无助情绪等抑郁样行为[18]。因此，慢性应激常用于抑郁模型的建立。本实验行为结果显示CUMS显著降低小鼠的糖水偏好度，延长绝望放弃时间，说明利用CUMS方法成功建立了小鼠抑郁样模型。海红米米糠干预显著改善由应激引起快感缺乏和绝望放弃的行为。同时本实验表明慢性应激诱发小鼠抑郁样行为与肠道细菌失衡密切相关。CUMS可使小鼠结肠中乳杆菌和双歧杆菌的数量显著下降，而增加了与炎症相关的微生物种类如梭菌的数量，前人也发现使小鼠肠道菌群失衡可出现抑郁样行为[23]。这与本研究团队多年证明的抑郁症免疫炎症假说相符[24]：应激刺激引发炎症过程， 促炎因子增加能激活血脑屏障中的某些转运机制，从血脑屏障渗漏区释放促炎细胞因子使其进入大脑最终导致抑郁症的发生[25]。喂食海红米米糠后，CUMS小鼠肠道菌群得到改善，这与海红米米糠富含营养物质如膳食纤维、微量元素以及多种生物活性物质，促进乳杆菌、双歧杆菌等优势菌属的生长，并能发挥益生元的作用有关[13, 14]。膳食纤维作为益生元之一，可以改善肠道微生物的组成[26]，增加摄入量可显著降低抑郁症的发病风险。还有研究发现黄酮能有效促进肠道中有益菌的增殖，减少致病菌，调节肠道菌群[27]。因此，本实验进一步证明肠道与中枢神经系统存在着双向调节。

本实验中，小鼠经历CUMS后，前额叶皮质中的5-HT、NE和DA及其代谢产物的含量均显著降低，这与抑郁病人的单胺类神经递质的合成和代谢减少、功能低下假说相符。给予海红米米糠治疗后，单胺类神经递质的合成代谢异常得到了显著的改善。已有研究发现DA能和5-HT能神经元功能降低可造成快感缺乏[28, 29]，而绝望和焦虑行为与5-HT能和NE能神经系统功能低下相关。前人研究发现多种肠道菌群如乳杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌等可产生神经递质，通过血液透过血脑屏障进入中枢神经系统后可显著改善神经递质水平，并引起情感相关的行为学改变[30-32]。研究还发现益生菌配方(瑞士乳杆菌R0052和长双歧杆菌R0175)可以抑制慢性应激导致小鼠外周皮质酮的升高，抑制下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴过度活跃[33]，改善中枢神经递质缺乏来发挥抗抑郁作用[18]。除此之外，益生菌还能通过脑源性神经营养因子(BDNF)与其受体酪氨酸激酶B (Trk B)信号通路来改善CUMS导致大鼠前额叶皮质中神经递质缺乏，从而改善大鼠的抑郁样行为[34]。而本研究在CUMS诱导的抑郁模型进一步证实了海红米米糠通过调节肠道微生物与神经递质的关系，起到了抗抑郁的作用。

从精神营养角度，海红米米糠富含的活性成分与改善抑郁的机制包括：1)γ-氨基丁酸(GABA)活性成分[9]，GABA具备改善抑郁、改善睡眠、提高免疫力、改善炎症等多种生理功能。2)海红米米糠富含阿魏酸，Zeni等[35]发现阿魏酸能够穿过血脑屏障，通过调节单胺能神经系统，减少小鼠尾悬和强迫游泳的不动时间，发挥抗抑郁的作用。3)海红米米糠所含的总黄酮不仅可以调节肠道菌群失调，还能增加5-HT、NE、DA浓度，产生抗抑郁的作用[36]。

4 结论

本研究表明海红米米糠可改善慢性应激诱导小鼠的抑郁样行为，其改善作用与改善肠道微生物和脑内神经递质含量相关。本实验为治疗抑郁症的药物或保健品研发提供了可能性，但海红米米糠的确切活性成分及调控作用更深层的分子水平机制仍有待研究。