响应面法优化库尔勒香梨各部位总多酚提取工艺及抗氧化活性研究

仵菲，买里得尔·叶拉里，白红进,*

（1新疆兵团南疆化工资源利用工程实验室，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

新疆库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yü)属于白梨系统，是蔷薇科（Rosaceae）梨属（Pyrus spp.）植物［1］，在新疆种植面积广、年产量高，果实一般呈黄绿色并略带红色。香梨中含有多糖、酚类化合物、维生素等营养成分，具有润肺、消痰、保肝利胆等功效［2］。

多酚类化合物是留存于植物中的次生代谢产物，在植物的果实、茎、叶中储藏量非常丰富［3-4］，具有显著的抗病毒、降血脂、清除自由基、保护心血管等作用，已经广泛应用于食品和医药领域［5］。近年来，不断有文献报道，从红枣［6］、烟草［7］、百香果［8］等植物中提取到多酚类物质，但对于库尔勒香梨果实不同部位多酚提取工艺优化的研究较少。多酚类化合物的提取方法目前大多是超声波辅助有机溶剂提取［9-12］，因为超声辅助法可加快有机溶剂渗透到植物细胞中，缩短提取时间、提高提取率［13］。响应面法是目前常用的试验优化方法，广泛应用于农业、生物、食品、化学等领域［14-15］，其特点是试验周期短、精密度高、预测性能好，并且能研究几种因素交互作用［16］。目前对于评价植物体外抗氧化活性的方法有很多，其中DPPH自由基清除能力是一种灵敏、简单易行的有效检测方法［17］。

本试验以新疆库尔勒香梨为试材，选用乙醇为有机溶剂，采用超声辅助法提取库尔勒香梨果实不同部位中的总多酚，通过单因素试验和响应面法优化提取工艺，通过DPPH自由基清除率测定其总多酚的抗氧化性能，掌握库尔勒香梨果实不同部位总酚含量的分布情况，为新疆南疆库尔勒香梨资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

供试材料为新疆库尔勒香梨，采集于新疆阿拉尔市塔里木大学校园内（81°17′41.61″E，40°32′23.50″N），将采集的香梨洗净后立即分离果皮、果肉、核外果肉和果核，-20℃保存备用。

没食子酸（AR）购自天津市光复精细化工研究所；福林酚试剂（AR）购自Solarbio公司；无水乙醇（AR）、NaNO2（AR，≥99.8%）、Al(NO3)3（AR，≥99.8%）、NaOH（AR，≥99.8%）、Na2CO3（AR，≥99.0%）等，购自天津市致远化学试剂有限公司；芦丁（≥97.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；DPPH购自成都埃法生物科技有限公司。

N-1001旋转蒸发仪，上海泉杰仪器有限公司；OSB-2100水浴热锅，上海泉杰仪器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；BS124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV1800可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

参考周丽萍等［18］研究方法，在760 nm处测定吸光度值，横坐标为没食子酸浓度，纵坐标为吸光度值，获得线性回归方程：y=12.350x+0.115，相关系数r2=0.999。

1.2.2 库尔勒香梨多酚的提取工艺

称取一定量的样品，加入70%的乙醇，料液比为1:15，50℃下超声提取40 min，抽滤后取上清液浓缩，按1.2.1的方法重复测定3次吸光度值。计算公式如下：

式（1）中，E为香梨多酚提取量，mg/g；C为总多酚质量浓度，mg/g·FW；V为多酚提取液定容的体积，mL；N为稀释倍数，W为库尔勒香梨原料质量，g。

1.2.3 单因素试验

在恒定的超声功率条件下，考察乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度4个因素对库尔勒香梨不同果实部位总多酚提取量的影响。固定其他3个因素，分别选取乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%、80%，料液比 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，提取时间 20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，提取温度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行单因素试验［19-20］，确定超声辅助提取库尔勒香梨多酚的最适提取工艺参数。

1.2.4 响应面优化工艺

以单因素试验的结果为基础，运用Box-Behnken响应面法优化库尔勒香梨果实各部位总多酚的提取工艺参数。以库尔勒香梨果实总多酚提取量为响应值，选取乙醇体积分数（A）、料液比（B）、时间（C）确定库尔勒香梨各部位总多酚的最佳提取工艺条件［21-22］。

1.2.5 DPPH自由基清除率

样品组：取7支试管分别吸取1.00 mL不同浓度的样品提取液与2.00 mL0.05 mmol/LDPPH溶液混匀；

对照组：1.0 mL无水乙醇与2.00 mL 0.05 mmol/L DPPH溶液混匀；

以无水乙醇作为空白对照，芦丁作为阳性对照，于517 nm处测定吸光度值。

DPPH自由基清除率［23-24］计算式为：

式（2）中，Y为DPPH自由基清除率；A0为波长517 nm处空白样品的吸光度值；A1为波长517 nm处样品的吸光度值。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

线性回归方程：y=12.350x+0.115，r2=0.999，如图1所示。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素试验结果分析

由图2可知，4个因素对库尔勒香梨果实不同部位总多酚提取量的影响趋势均呈现先增后减的趋势，其中果皮和果核的变化趋势较为明显。由图2（a）可以看出，随着乙醇体积分数的升高，库尔勒香梨果实不同部位的总多酚提取量呈现先增后减的趋势，乙醇体积分数在70%左右总多酚的提取量最高，宋慧等［25］也证明了采用体积分数70%的乙醇溶液提取梨皮多酚效果最好，故选择乙醇体积分数70%作为进一步工艺优化试验条件；由图2（b）可以看出，随着料液比的增大，总多酚提取量先增加后降低，其中料液比为1:15时，库尔勒香梨果实不同部位总多酚的提取量最高，故选择料液比在1:15作为进一步工艺优化试验范围；由图2（c）可以看出，随着提取时间不断延长多酚提取量先升高，40 min后逐渐下降，因此选择提取时间30～50 min作为进一步工艺优化试验范围；由图2（d）可以看出，随着提取温度不断升高，总多酚的提取量呈先增加后减小的趋势，在40℃时达到最高值，因此选择30～50℃作为进一步工艺优化试验范围。

图2 不同试验因素对库尔勒香梨果实各部位多酚提取率的影响

2.3 响应面优化总多酚提取工艺

利用Design Expert 8.0.6软件分析得到的香梨果实各部位总多酚的多元二次回归模拟方程如下式所示，其中，Y表示库尔勒香梨果实总多酚含量的预测值，e为自然常数。

Y（果皮）=17.02+0.25A+0.021B-0.032C-2.500e-0.03AB-0.030AC-0.065BC-0.47A2-0.27B2-0.12C2

Y（果肉）=0.50+0.019A+3.750e-0.03+0.014C+0.020AB-7.250e-0.03AC-0.026BC-0.13A2-0.095B2-0.045C2

Y（核外果肉）=0.53+0.013A+0.012B+6.375e-0.03C+0.024AB+0.023AC-1.000e-0.03BC-0.15A2-0.13B2-0.10C2

Y（果核）=6.03+0.26A-0.032B+0.030C+0.14AB+0.015AC-0.090BC-1.09A2-0.57B2-0.48C2

库尔勒香梨果皮中总多酚的响应面回归模型的方差分析见表1。该模型的相关系数r2=0.988 3，P＜0.000 1（差异极显著）；失拟项P值为0.463 0＞ 0.05（不显著），表明模型的预测值与实测值拟合程度较高，因此该模型能够预测库尔勒香梨果皮总多酚提取量［26］。通过F值分析可知，各因素对总多酚提取量影响的大小顺序为：乙醇体积分数（A）＞时间（C）＞料液比（B）。

表1 库尔勒香梨果皮中多酚的回归方程方差分析

库尔勒香梨果肉中总多酚的响应面回归模型的方差分析见表2。该模型的相关系数r2=0.849 6，P＜0.041具有显著性；失拟项P 值0.105 7＞ 0.05（不显著），说明拟合情况良好。通过F值分析可知，各因素对总多酚提取量影响的大小顺序为：乙醇体积分数（A）＞时间（C）＞料液比（B）。

表2 库尔勒香梨果肉中多酚的回归方程方差分析

库尔勒香梨核外果肉中总多酚的响应面回归模型的方差分析见表3。该模型的相关系数r2=0.914 2，P＜0.005 4（差异极显著）。该模型的纯误差均方和较小为4.480e-0.05，说明此模型有效，应用响应面发优化提取香梨总多酚的提取工艺可行［27］。通过F值分析可知，各因素对总多酚提取量影响的大小依次为：乙醇体积分数（A）＞料液比（B）＞时间（C）。

表3 库尔勒香梨核外果肉中多酚的回归方程方差分析

库尔勒香梨果核中总多酚的响应面回归模型的方差分析见表4。该模型决定系数r2=0.995 3，P＜0.000 1（差异极显著）；失拟项P值0.394 9＞0.05（不显著），说明实测值与预测值之间拟合程度较高。该模型的纯误差均方和较小为5.170e-0.03，说明此模型有效，应用响应面法优化提取香梨总多酚的提取工艺可行［28］。通过F值分析可知，各因素对总多酚提取量影响的大小依次为：乙醇体积分数（A）＞料液比（B）＞温度（C）。

表4 库尔勒香梨果核中多酚的回归方程方差分析

2.4 模型验证试验

将库尔勒香梨果实总多酚的最佳提取条件调整为体积分数70%的乙醇，料液比为1:15，温度40℃下提取40 min，在此工艺条件下得到果皮、果肉、核外果肉和果核中总多酚的提取量分别为(17.060±0.400)mg/g·FW、(0.532±0.053)mg/g·FW、(0.530±0.032)mg/g·FW和(6.100±0.200）mg/g·FW（试验3次取平均值），与预测值16.985 mg/g·FW、0.507 mg/g·FW、0.538 mg/g·FW和5.974 mg/g·FW，实测值与预测值之间差距不大，说明该模型可行有效。

2.5 抗氧化活性的测定

由图3可知，在试验浓度范围内，库尔勒香梨果肉、核外果肉和果核中总多酚对DPPH自由基的清除效果低于芦丁，但随浓度的增加，对DPPH自由基的最大清除率达50%～70%，果皮对DPPH自由基的清除效果大于阳性对照（芦丁）试验为85%，随着浓度的增加，两者的清除率趋于接近。由图4可知，IC50值越小抗氧化活性越强，各部位的抗氧化活性由强到弱的次序为：果皮＞果核＞核外果肉＞果肉。综上分析，库尔勒香梨果皮的多酚对DPPH自由基有明显（P＜0.05）的清除效果。

图3 库尔勒香梨果实各部位多酚对DPPH自由基的清除率

图4 库尔勒香梨果实各部位多酚对DPPH自由基的IC50值

3 结论与讨论

本试验以库尔勒香梨为试材，采用超声辅助提取法提取其果实不同部位中的总多酚，通过单因素和响应面工艺优化试验确定了影响香梨不同部位中总多酚的最佳提取工艺为乙醇体积分数70%，料液比1:15，提取时间40 min，提取温度40℃，库尔勒香梨果皮、果肉、核外果肉和果核中总多酚的提取量分别为(17.060±0.400)mg/g·FW、(0.532±0.053)mg/g·FW、(0.530±0.032)mg/g·FW、(6.100±0.200)mg/g·FW，苏艳丽等［29］以100%的甲醇为溶剂，采用超声辅助提取法测得的梨果多酚提取量为0.0564 mg/g，相比之下，本研究采用乙醇为溶剂不仅毒性小且多酚提取效果更好。库尔勒香梨果皮、果肉、核外果肉和果核中总多酚对DPPH自由基清除率最高时分别为85%、60%、67%、72%，且IC50值从低到高次序为：果皮＞果核＞核外果肉＞果肉，故新鲜库尔勒香梨果皮中总多酚含量较高且抗氧化能力较强，高于宋慧等［25］研究的梨皮多酚的DPPH自由基清除率。目前随着对库尔勒香梨果实酚类物质的深入研究，对于香梨不同果实部位酚类物质的开发日益上升，但是对库尔勒香梨果实不同部位多酚提取工艺的研究较少，故本试验可为梨品种总多酚的提取提供技术参考，为进一步开发天然抗氧化剂提供理论依据。