芪连结肠宁对溃疡性结肠炎大鼠TLR4/NF-κB 信号通路及肠黏膜保护因子的影响

胡锦洋，牛俊杰，蒋士生

（湖南省中医药研究院附属医院，长沙 410006）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）属于炎症性肠病的一种，常表现为便血、腹痛腹泻、消瘦等症状，易反复发病且难以治愈，严重影响患者生存质量[1]。目前溃疡性结肠炎的发病机制不明，但考虑多与遗传、环境、免疫、肠道菌群失调等有关，其中肠黏膜屏障被认为是溃疡性结肠炎病理进展的中心环节[2]。芪连结肠宁具有显著的促进溃疡恢复和健脾止泻的功效[3]。此次研究旨在通过检测肠黏膜保护因子黏蛋白2（MUC2）、肠三叶因子（TFF3）以及TLR4/NF-κB炎症信号通路相关指标，探讨芪连结肠宁对肠黏膜屏障及肠道炎症因子的影响，为芪连结肠宁治疗溃疡性结肠炎提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性2 月龄SD 大鼠50 只，体质量（160±15）g，购自湖南斯莱克景达实验动物中心，许可证号：SYXK（湘）2020-0008；饲养于湖南中医药大学动物实验中心，实验动物伦理审查号：2021-0088；12 h/ 12 h 明暗交替，室温（25±3）℃，相对湿度65%，噪音≤60 dB，适应性喂养3 d 后开始造模。芪连结肠宁组成：黄芪15 g，党参15 g，炒白术15 g，茯苓15 g，陈皮10 g，黄连10 g，炮干姜6 g，蒲黄10 g，蒲公英15 g，败酱草15 g，椿根皮10 g，木香10 g，白芍15 g，甘草5 g。药物浸泡于蒸馏水中40 min，第一煎大火煮沸后，小火煎煮30 min；第二煎大火煮沸后，小火煎煮20 min，最后将2 次煎煮汤药混合浓缩制成含生药2.48 g/mL 的药液。所有中药材均购于湖南省中医药研究院附属医院中药房，4 ℃保存，使用前预热。葡聚糖硫酸钠（上海翊圣生物公司，批号D2021571）；Trizol（美国Thermo 公 司，批号10296010）；HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR、qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞公司，批号QV114-01、QV318-12）；兔IgG-免疫组化试剂盒、HRP-羊抗兔IgG、Anti-GAPDH Antibody、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物公司，批号15H1L16F0334、BST15H06A15H65、BST14H06A18G11、BST16H18B51）；Anti-NF-κB p65 Antibody、Anti-TLR4 Antibody、Anti-IL-6 antibody、Anti-TNF alpha antibody、Anti-MUC2 antibody（英国Abcam 公司，批号ab 22048、ab 32536、ab 233706、ab 215188、ab 272692）；伊红染液、苏木素染液（Servicebio 公司，批号：ZH201285、ZH209148）。

Nanodrop 超微分光光度仪（美国Thermo，型号：Nanodrop 200）；实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad，型号：CFX 96）；石蜡切片机（德国徕卡，型号：RM 2235）；BX 43 光学显微镜（Olympus 公司，型号：IX 73-U）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司，型号：SpectraMax 5）；高速冷冻离心机（日本日立，型号：CR22G Ⅱ）；凝胶成像系统（美国伯乐，Gel Doc XR+）。

1.2 动物分组与造模 采用随机数字表法将50 只SD大鼠随机分为正常组、模型组、芪连结肠宁低剂量组、芪连结肠宁中剂量组及芪连结肠宁高剂量组，每组10只。根据文献研究[4]，采用5%葡聚糖硫酸钠（DSS）喂养建立溃疡性结肠炎大鼠模型。除正常组外，用蒸馏水配制浓度为5%的葡聚糖硫酸钠溶液，放入饮水瓶中自由饮用，连续用药7 d。造模第7 天随机选取2只大鼠处死，通过观察大鼠体质量、大便性状、出血情况进行DAI评分，以及结肠黏膜损伤程度、结肠黏膜病理组织学检查评价UC 大鼠模型建模成功。计算公式：DAI=（体质量下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。

表1 DAI评分量表

1.3 干预方法及DAI测定 造模结束后第2 天起开始灌胃给药。根据人临床用量的等效剂量和动物体表面积计算[5]，芪连结肠宁低、中、高剂量组分别给予含生药为1.24、2.48、4.96 g/Kg 的中药灌胃，空白组、模型对照组均以蒸馏水灌胃。以上各组均每日2 次，连续3 周。分别于给药前及给药后每周末观察大鼠体质量变化，进食、活动及粪便情况，根据体质量下降、粪便性状和隐血情况，计算DAI。

1.4 HE 染色观察结肠组织形态 大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉，立即暴露腹腔及胸腔，以生理盐水行心脏灌注，快速取结肠组织，生理盐水洗净，滤纸吸干水分，一部分放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，苏木素伊红染色，镜下观察结肠组织形态。另一部分结肠组织液氮速冻，然后-80 ℃保存用于后续检测。

1.5 免疫组化法观察结肠组织MUC2 表达情况 取部分结肠组织石蜡切片脱蜡水化。3%H2O2封闭10 min，消除内源性过氧化物酶，微波抗原修复后，5%BSA 封闭30 min。一抗4 ℃（1:200）孵育过夜，二抗室温（1:200）孵育30 min，DBA 显色。光学显微镜下观察。结果通过Image-Pro Plus 6.0 对MUC2 的平均光密度（IOD 值）进行半定量分析。

1.6 Western blot检测结肠组织TLR4、NF-κB p65、MUC2、IL-6、TNF-α 蛋白表达水平 取适量结肠组织冰上匀浆，裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，收集上清冻存-80 ℃备用。BCA 法对蛋白定量。适量蛋白样品进行电泳分离，5%浓缩胶60 V，10%分离胶90 V；然后湿转90 min，电流300 mA，5%脱脂牛奶封闭1 h，加一抗，4 ℃摇床过夜。次日，TBST 漂洗3 次，二抗（1:10 000）室温孵育90 min，TBST 漂洗3 次，添加ECL 发光液暗室曝片。用ImageJ v1.8.0软件分析各条带灰度值，进行定量分析，统计各组与β-actin 灰度值的比值。

1.7 实时荧光定量PCR 检测结肠组织MUC2、TFF3 mRNA 的表达 采用TRIZOL 试剂提取结肠组织细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA 的质量和浓度。参照逆转录试剂盒说明，进行逆转录，合成c DNA；然后进行PCR 扩增，反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s；72℃延伸30 s；40个循环，溶解曲线 60～95 ℃测溶解曲线，得出内参及各指标Ct值。引物由南京诺唯赞生物科技有限公司合成，引物序列如下表2。根据相对定量法2-ΔΔCt计算出mRNA 的相对表达量。

表2 RT-qPCR 引物序列

1.8 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差（）表示，组间数据比较采用ANOVA 方差分析，用LSD 法（方差齐）或Dunnett's T3（方差不齐）作组间多重比较。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化及给药前后DAI评分比较 见表3、表4。与正常组比较，模型组大鼠体质量明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，芪连结肠宁各剂量组大鼠体质量均有不同程度增加（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，芪连结肠宁各剂量组大鼠在给药第7、14、21 天时DAI评分均不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01）；与芪连结肠宁中剂量组比较，低剂量组大鼠在给药第21 天时DAI评分增加（P＜0.05）。

表3 各组大鼠体质量变化情况比较（，n =10）g

表3 各组大鼠体质量变化情况比较（，n =10）g

注：与正常组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与芪连结肠宁中剂量组比较，▲P ＜0.05

表4 各组大鼠疾病指数活动评分（DAI）比较（，n =10）

表4 各组大鼠疾病指数活动评分（DAI）比较（，n =10）

注：与正常组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与芪连结肠宁中剂量组比较，▲P ＜0.05

2.2 各组大鼠结肠组织病理学观察 正常组大鼠肠道黏膜上皮完整，存在大量正常的杯状细胞，隐窝形态正常，腺体排列整齐规则，各层结构未见异常，未见炎性细胞浸润。模型组黏膜上皮细胞脱落坏死，大量杯状细胞丢失，黏膜层及黏膜肌层有大量炎性细胞浸润。芪连结肠宁低、中、高剂量组大鼠结肠黏膜病变均较模型组有不同程度的减轻，存在较多的杯状细胞和隐窝，腺体排列尚规则，炎性细胞浸润也相对减少，且中、高剂量组较为明显。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理改变情况（HE，n =10，×200）

2.3 各组大鼠结肠MUC2蛋白表达观察 如图2所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织MUC2 蛋白表达减少（P＜0.01）；与模型组比较，芪连结肠宁各剂量组大鼠结肠组织MUC2 蛋白表达均不同程度增加（P＜0.01）；与芪连结肠宁中剂量组比较，低剂量组大鼠结肠组织MUC2 蛋白表达减少（P＜0.05）。

图2 A1-A5 为各组大鼠结肠MUC2 蛋白表达情况（免疫组化，×200）；B 为各组大鼠结肠组织MUC2 蛋白平均积分光密度值比较（，n =10）

2.4 各组大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α、MUC2、TFF3蛋白表达水平比较 如图3所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α、MUC2、TFF3 蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，芪连结肠宁各剂量组大鼠结肠组织TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白表达均有不同程度的下降（P＜0.05，P＜0.01），MUC2、TFF3 蛋白表达均明显增加（P＜0.01）；与芪连结肠宁中剂量组比较，低剂量组大鼠结肠组织TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白表达增加（P＜0.05，P＜0.01），MUC2、TFF3蛋白表达降低（P＜0.01）。

图3 A 为各组大鼠结肠组织蛋白电泳条带图（Western blot）；B1～B7 为各组大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α、MUC2、TFF3 蛋白相对表达量比较（，n =10）

2.5 各组大鼠结肠组织MUC2、TFF3 mRNA 表达情况比较 见表5。

表5 各组大鼠结肠黏膜MUC2、TFF3m RNA 的表达情况（，n =5）2-△△Ct

表5 各组大鼠结肠黏膜MUC2、TFF3m RNA 的表达情况（，n =5）2-△△Ct

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与芪连结肠宁中剂量组比较，△P ＜0.05

3 讨论

溃疡性结肠炎（UC）根据其发病特点可归于中医的“泄泻”“久痢”“肠风”等病，发病主要以素体脾胃虚弱为基础，兼之感受外邪或饮食、情志失调等诱因，导致湿、热、瘀、毒、痰等郁结肠道，气血凝滞，肠络损伤，壅为脓血，遂发病[6]。本课题组蒋士生教授认为溃疡性结肠炎的治疗关键应从脾胃入手，以“脾胃虚弱，湿热蕴肠”为病机特点，提出活动期“标本同治”，缓解期“扶正固本”的学术思想[7-8]；芪连结肠宁方中黄芪补中益气，黄连清泄中焦湿热，二药攻补兼施，相须为用，同为君药；人参、白术、陈皮补气健脾祛湿，黄连、干姜辛开苦降、寒温并用，蒲黄、蒲公英、败酱草、椿根皮清热活血、涩肠祛瘀，木香调理肠道气机，白芍酸甘敛阴止痛，甘草调和诸药，全方共奏补脾健胃祛湿、活血拔腐生新、收敛固涩止泻之功效[9-11]。本次研究结果显示，芪连结肠宁各剂量组大鼠在给药后体质量均增加，DAI评分逐渐降低，结肠组织病理损伤均有不同程度的恢复。

MUC2 是由杯状细胞分泌的一种形成黏液凝胶的分泌型寡聚体黏蛋白，在肠黏膜修复重建及肠黏膜免疫屏障中具有重要作用[12]。肠道黏液层是抵御致病微生物或其他毒素的重要机械屏障，当外源或内源性刺激物及致病菌入侵时，肠道黏膜上的杯状细胞Toll 样受体（TLRs）受到刺激并激活相应下游信号传导通路，聚集周围杯状细胞大量分泌黏液以隔绝致病因子，保护肠黏膜上皮细胞[13]。本研究中，模型组大鼠结肠组织MUC2 蛋白表达明显降低，可能与杯状细胞大量凋亡导致其无法分泌MUC2 有关，而芪连结肠宁各剂量组大鼠结肠组织MUC2 蛋白表达均不同程度升高，提示芪连结肠宁能在一定程度上恢复杯状细胞分泌MUC2 蛋白的功能，从而对溃疡性结肠炎起到治疗作用。TFF3 主要是由黏膜细胞、杯状细胞、腺细胞合成分泌进入肠道，众多研究表明其主要与黏蛋白相互作用，调控黏液层的酸渗透及增加黏液的黏度从而发挥保护肠黏膜的生理功能[14]。TFF3 还可通过刺激血管表皮生长因子的表达，促进血管生成，修复肠上皮[15]。本研究中，芪连结肠宁各剂量组大鼠结肠组织TFF3蛋白表达及TFF3 mRNA 表达均明显增加[16]。

溃疡性结肠炎作为一种原因不明的肠道慢性炎症性疾病，与机体免疫功能紊乱密不可分[17-18]。TLR4是TLRs 家族的重要一员，其介导的信号传导通路是溃疡性结肠炎病理进展的重要一环[19]。当TLRs 与革兰氏阴性菌内毒素脂多糖（LPS）相结合识别后促使I-κB 发生磷酸化并降解，NF-κB 被激活，启动和调节TNF-α、IL-6 等炎症因子表达，加剧肠道炎症反应；释放的炎症因子又可逆向激活NF-κB，形成正反馈调节，进一步加重炎症状态[20]。本研究中，模型组大鼠结肠组织TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白表达明显增加，而芪连结肠宁各剂量组大鼠均不同程度降低，表明芪连结肠宁能有效调节TLR4/NF-κB 炎症信号通路发挥对溃疡性结肠炎的治疗作用。

综上，芪连结肠宁能有效改善溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织的病理损伤，降低DAI评分，降低结肠组织TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白表达，增加MUC2 及TFF3 表达，从而达到治疗溃疡性结肠炎的目的；其机制可能是通过调节杯状细胞黏液分泌，增强肠黏膜屏障的保护功能，进而抑制TLR4/NF-κB信号传导通路的活化有关。其中芪连结肠宁中、高剂量组疗效及调节作用较为显著。