固相萃取-超高效合相色谱法测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物氟苯尼考胺的含量

张文华，胡起立，侯建波，毛壬熠，徐 可，王良莉，谢 文，徐敦明，沈伟健

(1.杭州海关技术中心,杭州 310016; 2.浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州 310016;3.厦门海关技术中心,厦门 361013; 4.南京海关动植物与食品检测中心,南京 210019)

氟苯尼考(FF)又称氟甲砜霉素,是一种新型的氯霉素类动物专用抗生素,主要代谢产物为氟苯尼考胺(FFA)[1-2],具有抗菌谱广、高效、安全等特点,在防治畜禽养殖过程中的细菌性疾病方面有广泛应用[3-4]。氟苯尼考在畜禽动物体内的半衰期长、分布较广,人长期食用氟苯尼考残留量超标的畜禽产品,可能产生头晕、呕吐、腹泻、过敏等症状。氟苯尼考存在两种对映体[5],分别为(－)-氟苯尼考左旋体[(－)-FF]和(＋)-氟苯尼考右旋体[(＋)-FF]。其中(－)-氟苯尼考左旋体具有抗菌活性,而(＋)-氟苯尼考右旋体无活性甚至对(－)-氟苯尼考的活性有一定抑制作用[6-8]。GB 31650－2019[9]只规定猪肉中氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺总残留限量为300μg·kg－1,并未单独规定对映体及代谢物的残留量。如果能进一步研究氟苯尼考的两种对映体及其代谢物氟苯尼考胺在猪肉中的残留量,将为氟苯尼考对映体残留分析提供更精准的判定。

目前国内外检测氟苯尼考对映体的方法主要为高效液相色谱法[7-8,10-12]。该方法分离度好,但存在检测时间较长、有机试剂消耗量大等问题,无法实现样品的快速分离检测。因此,开发一种快速、高效的检测方法具有广泛的应用前景。超高效合相色谱法(UPC2)主要以超临界状态的二氧化碳为流动相主体,加入少量甲醇、乙腈、异丙醇等助溶剂,通过调节柱温、系统背压及助溶剂的比例来改变二氧化碳的密度和洗脱能力,从而精确调控目标化合物的分离,该方法对结构相似的手性化合物具有很好的分离效果[13-17],但还未见其在氟苯尼考对映体的分离及残留量测定分析中的报道。鉴于此,本工作开发了UPC2分离和测定两种氟苯尼考对映体及其代谢物氟苯尼考胺含量的方法,并应用于猪肉中氟苯尼考及其代谢物的分离和残留量的测定,以期为畜禽类产品中的氟苯尼考对映体及代谢物残留测定提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity型超高效合相色谱仪;AE260 型电子天平;R215 型旋转蒸发仪;ELGA CLXXXUVM2型超纯水净化系统;MS2 型涡旋混匀器;NEVAPTM 111 型氮吹仪;Oasis HLB 固相萃取柱(3 mL,60 mg)。

单标准储备溶液:1.0 g·L－1,取两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺标准品各0.01 g(精确至0.1 mg),用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。

混合标准溶液系列:取一定量的两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的单标准储备溶液,用体积比8∶2的正庚烷-异丙醇混合溶液逐级稀释,配制成0.50,1.00,2.00,4.00,10.00,20.00 mg·L－1的 混 合标准溶液系列。

磷酸盐缓冲溶液:pH 6.0,取8.00 g磷酸氢二钾和2.00 g磷酸二氢钾,用水溶解并定容至1 L 容量瓶中。

氟苯尼考胺标准品的纯度不小于99.7%;(－)-氟苯尼考和(＋)-氟苯尼考标准品的纯度不小于99.0%。

乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、正庚烷、乙酸乙酯均为色谱纯;氨水、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾均为分析纯;二氧化碳纯度为99.999%;其他所用试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

CHIRALPAK AD-3 手性色谱柱(150 mm×3.0 mm,3μm),填料为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯);检测波长224 nm;系统背压13.8 MPa;柱温40 ℃;流动相A为二氧化碳,B 为含0.5%(体积分数,下同)氨水的甲醇溶液;梯度洗脱程序:0～2.0 min时,B为10%;2.0～3.0 min时,B 由10%升至25%,保持3.0 min;6.0～6.1 min时,B 由25% 跳转至10%,保持2.0 min。流量1.0 mL·min－1;进样量5.0μL。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的提取

取10.0 g(精确至0.01 g)猪肉样品置于50 mL具塞离心管中,加入25 mL含3%(体积分数,下同)氨水的乙酸乙酯溶液,涡旋1 min混匀,在3 000 r·min－1转速下离心5 min,吸取上清液至浓缩瓶中,以25 mL含3%氨水的乙酸乙酯溶液重复提取一次。合并两次上清液,于40℃水浴中减压浓缩至近干,加入10 mL 磷酸盐缓冲溶液分次溶解残渣,待净化。

1.3.2 样品的净化和测定

这一点显而易见，毋庸多言。阅读原汁原味的军事名著在语言上也会一种修炼提高。很多世界军事名著都是以英语呈现的，通过阅读这些军事名著，真正了解其内涵，学员的英语阅读、理解及表达能力都会有所提高。而对于原著不是以英语呈现的世界军事名著，可以将其通行英译本及中译本对照阅读。对照阅读有助于学员发现译者理解上的不同，从而更加能动地参与阅读、加深理解。

依次用3mL甲醇、3mL水活化HLB 固相萃取柱。将上述待净化溶液注入活化好的HLB 固相萃取柱中,用10 mL水淋洗,弃去淋洗液,真空抽柱1 min,用6 mL甲醇洗脱,洗脱液收集在15 mL 离心管中,于40℃氮吹至近干,加入1 mL体积比8∶2的正庚烷-异丙醇混合溶液,涡旋3 min充分溶解残渣,过0.22μm 有机滤膜,滤液供UPC2分析。

2 结果与讨论

2.1 提取试剂的选择

文献报道的氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的提取试剂通常为乙酸乙酯[18-20]、水-丙酮混合溶液[21]、乙腈[22-23]、甲醇[24]等,因此试验比较了这几种试剂的提取效果。结果显示:采用水-丙酮混合溶液、乙腈或甲醇提取时,典型目标物氟苯尼考胺的回收率分别为71.3%,75.7%,53.2%;采用乙酸乙酯提取时,氟苯尼考胺的回收率为76.9%,提取效果相对较好。氟苯尼考胺为弱碱性物质,为增加其提取率,试验选择在乙酸乙酯中加入适量氨水,当氨水的体积分数为3%时,氟苯尼考胺的回收率为95.4%,且其色谱峰附近的干扰峰较少。因此,试验选择含3%氨水的乙酸乙酯溶液作为提取试剂。

2.2 固相萃取柱的选择

试验考察了Oasis HLB 混合型阳离子交换固相萃取柱(3 mL,60 mg)、亲水亲脂Oasis HLB 固相萃取柱(6 mL,200 mg)和非极性疏水Supleco C18固相萃取柱(3 mL,500 mg)对猪肉中氟苯尼考及其代谢物净化效果的影响。结果表明:与MCX 固相萃取柱相比,采用C18或HLB固相萃取柱净化后的色谱图中目标化合物色谱峰附近的干扰峰较少;采用3种固相萃取柱净化后,3种目标化合物的回收率依次为32.8%,97.7%,80.1%,HLB 固相萃取柱所得结果的准确度较高。因此,试验选择HLB 固相萃取柱对样品进行净化。

2.3 定容试剂的选择

试验比较了5 种常用定容试剂甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、正庚烷对两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺分离效果的影响。结果显示:在5种定容试剂中,正庚烷所得两种氟苯尼考对映体的色谱分离度和响应情况较好,异丙醇所得氟苯尼考胺的色谱响应情况较好。

为了保证两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺具有良好的色谱分离及响应效果,试验选择以正庚烷-异丙醇混合溶液作定容试剂,并考察了不同体积比正庚烷-异丙醇的混合溶液对3种目标化合物分离效果的影响,见图1。

图1 正庚烷-异丙醇的体积比对(＋)-氟苯尼考、(－)-氟苯尼考和氟苯尼考胺分离效果的影响Fig.1 Effect of volume ratio of n-heptane to isopropanol on the separation of(＋)-florfenicol,(－)-florfenicol and florfenicol amine

由图1可知:混合溶液中正庚烷的占比越高,(－)-氟苯尼考的峰形越尖锐;异丙醇的占比越高,氟苯尼考胺的峰形越尖锐。综合考虑3种目标化合物的峰形,试验选择体积比8∶2的正庚烷-异丙醇混合溶液作为定容试剂。

2.4 系统背压的选择

在UPC2分析中,常通过调节系统背压来控制二氧化碳在仪器运行过程中的超临界状态,从而改变其对物质的洗脱能力、溶解能力和选择性。由于二氧化碳在压力超过7.38 MPa、温度不小于31 ℃时才会进入超临状态,因此试验在此基础上,考察了系统背压分别为10.3,13.8,17.2,20.7,24.1 MPa时对目标化合物分离效果的影响。结果表明,随着系统背压的增加,3种目标化合物的分析时间逐渐缩短,(－)-氟苯尼考峰高逐渐降低,(＋)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的色谱峰高逐渐升高。综合考虑色谱峰形、峰高、保留时间等因素,试验选择的系统背压为13.8 MPa。

2.5 柱温的选择

在UPC2分析中,柱温对目标化合物的保留时间和分离度有一定影响,当柱温升高,超临界二氧化碳流体的密度发生改变,流动相黏度减小,目标化合物的洗脱能力也随之降低,保留时间相应延长。以CHIRALPAK AD-3 手性色谱柱的最高使用温度(40 ℃)和二氧化碳进入超临界状态的最低温度(31 ℃)为限值,试验考察了柱温分别为31,35,40 ℃对3 种目标化合物分离效果的影响,如图2所示。

由图2可知:当柱温为31 ℃和35 ℃时,3 种目标化合物中只有(－)-氟苯尼考得到完全分离,(＋)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的色谱峰未能实现完全分离;当柱温达到40 ℃时,3种目标化合物完全分离,且峰形良好。因此,试验选择的色谱柱柱温为40 ℃。

图2 柱温对(＋)-氟苯尼考、(－)-氟苯尼考和氟苯尼考胺分离效果的影响Fig.2 Effect of column temperature on the separation of(＋)-florfenicol,(－)-florfenicol and florfenicol amine

2.6 色谱行为

按照仪器工作条件分析混合标准溶液,如图3所示。

图3 混合标准溶液的色谱图Fig.3 Chromatogram of the mixed standard solution

由图3可知,(－)-氟苯尼考、(＋)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的分离效果良好,在5.0 min内全部实现了有效分离,分离度分别为4.0 和1.8,均大于1.5,符合完全分离的要求[25]。

2.7 标准曲线和测定下限

按照仪器工作条件分析混合标准溶液系列,以3种目标化合物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,3种目标化合物标准曲线的线性范围均为0.50～20.00 mg·L－1,线性回归方程和相关系数见表1。

以阴性猪肉样品加标的方法进行试验,以不小于10倍信噪比对应的含量作为测定下限,所得结果见表1。

表1 线性参数和测定下限Tab.1 Linearity parameters and lower limits of determination

2.8 精密度和回收试验

按照试验方法对阴性猪肉样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

由表2 可知,3 种目标化合物的回收率为81.2%～107%,测定值的RSD为5.0%～9.0%,回收率和精密度符合GB/T 27404－2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[26]的要求,能够满足猪肉样品的分析要求,可用于日常分析检测。

2.9 样品分析

按照试验方法分析20份市售猪肉样品。结果显示,20 份猪肉样品中均未检出(＋)-氟苯尼考,1份猪肉样品中检出(－)-氟苯尼考(248 μg·kg－1),与文献[8,11,13]采用HPLC分析氟苯尼考样品所得的结论相符,即供试品中的氟苯尼考主要为(－)-氟苯尼考。

本工作采用UPC2分离氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺,并对猪肉中氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的残留量进行测定。使用氨化乙酸乙酯对样品进行提取,通过HLB固相萃取柱对样品进行净化后,采用CHIRALPAK AD-3手性色谱柱分离,以超临界二氧化碳和含0.5%氨水的甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱,外标法定量,方法精密度和准确度均较好,可用于猪肉中相关物质的检测。