RVVC患者阴道微生物的物种组成及其变化情况

欧丽滢 周琛斐 蔡慧华 刘木彪

【摘要】 目的 探討复发性外阴阴道假丝酵母菌病（RVVC）患者阴道微生物的物种组成及其变化情况。方法 招募6例RVVC患者，纳入患者均在发作间期每日采集1份高位阴道拭子进行阴道微生物的物种检测，并运用主坐标分析法（PCoA）、绘制样品热图、α多样性分析等方法分析RVVC患者阴道微生物的物种组成及其变化情况。结果 组间PCoA结果显示RVVC患者阴道微生物物种在发作间期的组成相似，但在临近发作期、发作日均出现物种差异增大的现象。样品热图分析提示，在RVVC发作期和发作间期阶段物种的距离较远，并在临近发作期的生物间差异性开始集中。RVVC患者阴道微生物物种组成结果分析显示，乳酸杆菌占比为64.25%，相对丰度在0.10%～1.00%的菌属有小类杆菌属、肠杆菌科、大芬戈尔德菌、奇异菌属、气球菌属、葡萄球菌属、厌氧球菌和乳球菌，相对丰度> 1.00%的菌属有乳酸杆菌属、普雷沃菌属、链球菌、加德纳菌和脲原体。样品α多样性分析结果提示在RVVC发作间期的物种丰度基本相似，临近发作期物种的丰度提升，在发作前大部分物种在较低的丰度水平。随访患者数个月经周期中以乳酸杆菌为绝对优势菌属，偶有波动但幅度不大，但在各组发作前均存在一过性的普雷沃菌增加，也存在加德纳菌的增加，时而波动，其他菌属（如小杆菌属、大芬戈尔德菌、奇异菌属、脲原体等）在月经期所占比例较低，偶有波动，其余菌属在月经周期维持在较低丰度水平。结论 RVVC患者阴道微生物以乳酸杆菌为主，阴道菌群相对稳定、波动性弱，临床对其治疗应注重阴道微生态环境的调理，或可通过恢复阴道菌群比例，达到治愈RVVC的目的。

【关键词】 复发性外阴阴道假丝酵母菌病;阴道微生物;物种组成;动态变化

Species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in patients with recurrent vulvovaginal candidiasis Ou Liying△， Zhou Chenfei， Cai Huihua， Liu Mubiao. △The Second School of Clinical Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510260， China

Corresponding author， Liu Mubiao， E-mail： liumb1972@126.com

【Abstract】 Objective To investigate the species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in patients with recurrent vulvovaginal candidiasis （RVVC）. Methods Six patients with confirmed symptomatic RVVC were enrolled in this study. During the onset of RVVC， 1 high vaginal swab sample was collected from each patient on a daily basis to identify the vaginal microbiota. Principal co-ordinate analysis （PCoA）， thermogram analysis and α diversity analysis were adopted to analyze the species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in RVVC patients. Results PCoA analysis between groups showed that the species composition of vaginal microbiota in patients with RVVC was similar at the interval between onset， but the species difference was increased at several days before the onset and on the day of onset. Thermogram analysis suggested that the distance between microbiota was large in the onset stage and at the interval between onset of RVVC， and the intermediate difference of microbiota began to converge at several days before the onset stage. The species composition analysis of vaginal microbiota in patients with RVVC showed that Lactobacillus accounted for 64.25%. Bacterial genera with relative abundance between 0.10% and 1.00% included Dialister， Enterobacteriaceae， Finegoldia magna， Atopobium， Aerococcus， Staphylococcus， Anaerococcus and Lactococcus. The genera with relative abundance of >1.00% consisted of Lactobacillus， Prevotella， Streptococcus， Gardnerella and Ureaplasma. The α diversity index evaluation results indicated that the species abundance at the interval between onset of RVVC was similar， which was increased approaching the onset stage， and most returned to a low level of species abundance before the onset. Lactobacillus was the absolute dominant genus during several menstrual cycles of patients receiving follow-up， with small fluctuations. However， there was a transient increase of Prevotella in each group before the onset， and there was also an increase in Gardnerella， which occasionally fluctuated. The proportion of the other genera such as Dialister， Finegoldia magna， Atopobium and Ureaplasma was relatively low， and with few fluctuations. The remaining genera remained at a low level during the menstrual cycle. Conclusions Lactobacillus is the main vaginal microbiota in patients with RVVC. Vaginal microbiota in RVVC patients are relatively stable， with few fluctuations. In clinical treatment， widespread attention should be diverted to the regulation of vaginal microecological environment and restoring the proportion of vaginal microbiota.

【Key words】 Recurrent vulvovaginal candidiasis; Vaginal microbiota; Species composition; Dynamic change

復发性外阴阴道假丝酵母菌病（RVVC）是复杂性外阴阴道假丝酵母菌病的一种，指患者经过治疗后临床症状和体征消失，且真菌学检查阴性，但仍有外阴瘙痒、排尿疼痛、阴道分泌物等症状，据报道约5%成年妇女有RVVC[1-2]。RVVC病因复杂、顽固不愈，其治疗策略成为临床研究热点[3]。RVVC的病原体中80%～90%为白色假丝酵母菌，研究发现RVVC发作期中假丝酵母菌数量增加，乳酸杆菌比例明显降低[4]。但也有学者认为指乳酸杆菌的减少并不会增加RVVC的发生风险，乳酸杆菌并非是假丝酵母菌的有效拮抗生物[5]。另有学者提出，假丝酵母菌和阴道菌群之间的失衡可能是发生RVVC的主要因素[6]。现阶段有关于RVVC阴道菌群特征的研究也有一定的争议[7]。近年基因组学分析显示，RVVC患者的阴道菌群与健康女性患者的阴道菌群间并无明显差异，且RVVC患者乳酸杆菌丰度并未明显下降，阴道菌群结构也无明显改变[8]。目前的研究结论并不能显示患者在RVVC发作间期阴道微生物物种的动态变化，同时现阶段对于阴道微生态系统和RVVC发作之间是否有关尚无定论。为此，本研究着重建立动态队列，并对样本不断取材，以期能够捕捉到RVVC发作间期及发作期的阴道微生物菌群结构的变化，为RVVC患者的靶向治疗提供参考。

对象与方法

一、研究对象

采取自愿原则，招募2017年在广东省人民医院妇科就诊的6名确诊为RVVC的患者为研究对象，分别记为RV-A～RV-F。患者年龄（37.21±6.14）岁。纳入标准：①已婚女性，年龄20～49岁;②有RVVC临床症状和体征，如外阴瘙痒、外阴灼痛、性交痛或尿痛、外阴红斑和水肿等，专科检查见外阴红肿、抓痕及外阴黏膜黏附有白色膜状物或阴道内有较多豆腐渣样分泌物;③实验室检查见假丝酵母菌的芽生孢子或假菌丝，或真菌培养阳性;④1年内有上述症状且经真菌学检查证实发作4次或以上，本次就诊治疗后返院且阴道分泌物真菌学复查结果阴性且未合并其他阴道炎症。排除标准：①既往有活动性细菌性阴道炎;②处于妊娠期或哺乳期;既往使用过免疫抑制类药物;③月经不规律或绝经;④入组前1周内服用过抗菌药物或抗真菌类药物;⑤有全身系统性疾病。本研究方案经广东省人民医院医学伦理委员会批准（批件号：2017230H），入组患者均已签署知情同意书。

二、方 法

1. 治疗方法

入组患者每次复发后均予盐酸特比萘芬阴道泡腾片治疗，50 mg/d，持续用药7 d。以留取高位阴道拭子（HVS）的首日作为入组的第1日，以患者RVVC再次发作日为观察终点。按每例患者留取阴道拭子的先后顺序编号，共取得235份阴道拭子进行测序，其中RV-A 24份（记为A1～A24）、RV-B 25份（记为B1～B25）、RV-C 75份（记为C1～ C75）、RV-D 29份（记为D1～29）、RV-E 54份（记为E1～E54）、RV-F 28份（记为F1～F28）。

2. RVVC患者阴道微生物的物种检测

采用生工生物工程（上海）股份有限公司的细菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒，按试剂盒说明书步骤抽提阴道拭子中的细菌DNA，应用微生物多样性建库测序流程检测微生物种类。通过使用BIPES流程对样本数据进行分析，随后使用UCHIME对嵌合体序列进行摘除，6例RVVC患者的样本数量为235份，测序共获得18 273 380对序列，经对双端序列质控、拼接后共产生16 192 661条高质量序列，每份样本至少产生39 517条高质量序列，平均产生68 905 条高质量序列。

三、统计学处理

应用R语言基于β多样性得到的矩阵绘制组间主坐标分析法（PCoA）图。基于4种距离算法[binary jaccard、bray curtis、unweighted Unifrac（限细菌）、weighted Unifrac（限细菌）]及R语言绘制样品热图，将数据进行物种或样品间丰度相似性聚类，再通过颜色梯度的变化直观地看出两两样品间的差异性。颜色梯度由蓝色到红色的变化表示样品间距离由近到远，即两两样品间的差异由小到大变化。细菌多样性和丰度图分别使用α多样性和堆积条形图制作。Shannon指数用于估算样品中微生物多样性，Shannon指数值越大，说明群落多样性越高。采用单因素方差分析比较6例RVVC患者Shannon指数间的差异，组间两两比较采用LSD-t检验。使用MicrobiomeAnalyst创建微生物组图。其他数据和分析均使用GraphPad Prism。

结 果

一、PCoA分析

R语言绘制的PCoA基于β多样性分析得到矩阵，展示样品间物种多样性差异，结果显示RVVC患者发作间期的物种组成相似，但在临近发作期及发作日均出现物种差异增大的现象，见图1。

二、样品热图分析

RVVC发作期和RVVC发作间期两者物种的距离较远，代表其生物的差异较大，而在发作期的前几日，其生物的中间差异开始靠拢，见图2。6例RVVC患者中的部分图例分析见图3。

三、RVVC患者阴道微生物的物种组成

6例RVVC患者阴道微生物物种组成分析结果显示，占比在0.10%～1.00%的菌属有小类杆菌属（0.98%）、肠杆菌科（0.97%）、大芬戈尔德菌（0.94%）、奇异菌属（0.91%）、气球菌属（0.85%）、葡萄球菌属（0.81%）、厌氧球菌（0.64%）和乳球菌（0.14%），而占比> 1.00%的菌属包含乳酸杆菌（64.25%）、普雷沃菌属（10.64%）、链球菌（8.24%）、加德纳菌（3.27%）和脲原体（1.84%）。

四、样品α多样性分析

RVVC患者发作间期的物种丰度基本相似，临近发作期均存在物种丰度的提升，发作前大部分又恢复在较低的物种丰度水平，见图4。6例Shannon指数比较差异有统计学意义（F = 13.205，P < 0.001），其中RV-D、RV-B组内多样性较低，RV-A次之，RV-C、RV-E、RV-F的α多样性较高，见图5。发作期前（RV-A发作前5～6 d、RV-B发作前1～4 d、RV-C发作前6～7 d、RV-D发作前5～8 d、RV-E发作前1～3 d、RV-F发作前5～6 d）存在物种丰度提升情况，临近发作期（发作前1～2 d）大部分又恢复在较低的物种丰度水平，见图6。

五、RVVC患者阴道微生物的物种动态变化

对RVVC患者个体进行动态菌谱图分析，在随访患者数个月经周期中以乳酸杆菌为绝对优势菌属，偶有波动但幅度不大，但在各组发作前均存在一过性的普雷沃菌属增加，也存在加德纳菌属的增加，时而波动，其他菌属（如小杆菌属、大芬戈尔德菌、奇异菌属、脲原体等）在月经期所占比例较低，偶有波动，其余菌属在月经周期维持在较低丰度水平，见图7。

讨 论

据不完全统计，2015年全球阴道假丝酵母菌病（VVC）患病人数高达1.38亿，约4.92亿女性曾罹患VVC，近年来VVC发病率有上升趋势[9]。现阶段临床针对VVC的治疗以局部抗真菌药物为主，但疾病的反复性成为患者康复的难点，积极探求针对RVVC病因的靶向治疗方案是目前临床急需解决的难题[10]。机体免疫因素、治疗不规范及耐药菌株的产生等被视为RVVC的可能病因，假丝酵母菌是RVVC的重要病原体，通常情况下假丝酵母菌以孢子相与阴道菌群处于共生状态，共同维持阴道内微环境的动态平衡和女性生殖健康[11]。阴道微生态环境变化与RVVC的发生发展密切相关，有报道显示RVVC发作期阴道乳酸杆菌明显减少，在抗真菌治疗基础上及时补充乳酸杆菌，有利于患者阴道微生态平衡的恢复，对减轻患者临床症状和降低RVVC复发率有积极意义[12]。有研究者指出，RVVC患者乳酸杆菌丰度并不高，与健康女性阴道菌群的组成并无明显差异，且证实乳酸杆菌的缺失并不明显增加RVVC患病风险[13]。但上述研究多为横断面研究且样本采集时间点存在差异，较难体现出RVVC患者致病病原体的动态变化过程。

既往研究多数采用清洁度来判断阴道炎症性疾病，但清洁度判断指标中的白细胞计数、上皮细胞计数仅可反映炎症的情况，并不能对患者的发病起到一定的预测作用，因此其在临床中的应用效果并不理想[14]。普遍认为阴道微生物与人体微环境保持动态平衡，评估RVVC患者阴道微生物的物种组成及其动态变化对指导其治疗有重要的临床指导意义[15]。有报道指出，RVVC患者阴道菌群的多样性有所降低，但多数RVVC患者的阴道优势菌属是乳酸杆菌[16]。本研究中通过对RVVC患者进行连续随访，并采集患者阴道分泌物观察RVVC发作前和发作过程中阴道菌群波动，以明确RVVC的最佳治疗时间，结果显示本组RVVC

患者阴道环境的优势菌群与既往报道的基本吻合，女性阴道中微环境中乳酸杆菌属占比最高（64.25%），占比在0.10%～1.00%间菌属有小类杆菌属、大芬戈尔德菌、奇异菌属等，而占比超过1.00%的菌属有乳酸杆菌属、普雷沃菌属、链球菌等，这些微生物在正常情况下可相互影响并保持一定比例，维持阴道微生态的动态平衡[17]。此外本研究还显示，在随访患者数个月经周期中，以乳酸杆菌为绝对优势菌属，偶有波动但幅度不大，在各组发作前均存在一过性的普雷沃菌属增加，也存在加德纳菌属的增加，时而波动，其他菌属（如小杆菌属、大芬戈尔德菌、奇异菌属、脲原体等）在月经期所占比例较低，偶有波动，其余菌属在月经周期维持在较低水平。由此推测普雷沃菌属和加德纳菌的繁殖或许可为假丝酵母菌提供一定的生存空间，但具体作用需要代谢组学的相关支持，在日后将进一步研究验证。另外，在月经周期和药物治疗情况下，RVVC患者阴道菌群波动甚微，提示RVVC患者阴道菌群对内外因素的干扰反应较小，菌群波动性较弱，提示阴道微生物系统失衡可能存在于整个RVVC发生发展阶段，由此初步说明一旦VVC进展成为RVVC，患者治愈的难度将明显增加，对于VVC患者的抗微生物药物治疗需规范且足量才能防止疾病的复发。

综上所述，RVVC患者的阴道菌群相对稳定，波动性减弱，且多数患者阴道微生物以乳酸杆菌为优势菌属，治疗中需重视阴道微生态环境的调理。但本研究仍存在局限性，如研究患者例数少，加之考虑到失访率及随访依从性问题，本次随访时间并不长，数据的同质性和异质性尚存疑。后续将针对性地对RVVC患者阴道菌群开展代谢组学研究，进一步探寻差异基因以明确具体的发病机制，为RVVC的靶向治疗提供参考。

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（收稿日期：2022-02-28）

（本文編辑：林燕薇）