当归补血丸指纹图谱及3种指标成分含量测定方法的建立

范佳儿 刘银榕 晁志 田恩伟

关键词当归补血丸;指纹图谱;阿魏酸;毛蕊异黄酮葡萄糖苷;黄芪甲苷;含量测定;质量控制

当归补血汤出自《内外伤辨惑论》，由当归、黄芪按1 ∶5 的比例配伍而成，具有益气生血的功效，主治血虚阳浮发热证，为甘温除热法代表方之一[1]。当归补血丸由当归补血汤改良而来：将当归160 g、黄芪400 g 粉碎成细粉，过筛，混匀，加炼蜜30～40 g 与适量的水，泛丸，干燥，即得[2-3]。当归补血丸中含有多种黄酮苷类、氨基酸类、有机酸类等成分[4]，具有补气养血的功效，用于身体虚弱、气血两虚，是妇科临床常用中成药[2]。

目前，仅有《中华人民共和国卫生部药品标准（中药成方制剂第一册）》从显微鉴别和薄层鉴别项对当归补血丸进行定性质量控制[2]，尚缺乏相应的定量标准。虽然有研究对当归补血丸开展了定量研究，分别建立了阿魏酸和藁本内酯含量测定的高效液相色谱（HPLC）法[5-6]，但上述研究也仅对组方中当归的指标成分进行了测定。当归补血丸中化学成分多样，仅对单一成分进行定量检测无法全面反映其整体质量。当归补血丸中以黄芪为君药，当归为臣药，处方具有补气生血的功效。毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷是黄芪中的主要药效成分，具有提高免疫力、抗癌等多方面的药理作用[7-10]，可作为质量评价指标。阿魏酸作为当归的主要有效成分之一，是2020 版《中国药典》（一部）规定的当归指标性成分，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁和保肝等药理作用[11-14]。鉴于此，本研究以来源于2 个厂家的15批当归补血丸为样本，建立HPLC指纹图谱，并同时采用HPLC法测定其中阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量，以期为当归补血丸质量标准的完善及其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有1260型HPLC仪、G1315B型二极管阵列（DAD）检测器（美国Agilent 公司），Alltech 3300 型蒸发光散射（ELSD）检测器（美国Alltech公司），BSA224S-CW型电子天平（德国Sartorius 公司），HH-S6 型水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司），YM-080S型超声波清洗机（深圳市方奥微电子有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

当归、黄芪药材由南方医科大学中医药学院田恩伟副教授于2020 年7 月分别从甘肃岷县、河北承德采集，并由其鉴定分别为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 和豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。本研究共收集了2 个厂家的15 批当归补血丸样品，其中来自A 厂家的样品有7 批（批号分别为20062022、19123021、21032722、21041122、20092021、21062221、20112321，规格为6 g×10 袋，编号S1～S7），来自B厂家的样品有8 批（批号分别为190204、190302、190306、190308、190311、190504、190505、190809，規格为6 g×10 袋，编号S8～S15）。阿魏酸对照品（批号110773-201915，纯度≥99.4%）、黄芪甲苷对照品（批号110781-202118，纯度≥96.9%）均购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司;毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号wkq21010405，纯度≥98%）购自四川省维克奇生物科技有限公司;乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Hypersil ODS2 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～10 min，5%A→8%A;10～15 min，8%A→12%A;15～25 min，12%A→20%A;25～35 min，20%A→25%A;35～42 min，25%A;42～50 min，25%A→40%A;50～65 min，40%A→80%A;65～75 min，80%A）;流速为1.0 mL/min;柱温为25 ℃;进样量为20 μL;DAD检测器的检测波长为250 nm（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、323 nm（阿魏酸）;ELSD检测器（黄芪甲苷）的条件为氮气流速1.5 L/min、漂移管温度80 ℃、增益值4。

2.2 混合对照品溶液的制备

取阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为1.242mg/mL 的阿魏酸母液、0.846 mg/mL 的毛蕊异黄酮葡萄糖苷母液、1.940 mg/mL 的黄芪甲苷母液。取各对照品母液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，得到阿魏酸质量浓度为124.2 μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度为84.6 μ g/mL、黄芪甲苷质量浓度为194.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取2 g 当归补血丸细粉于锥形瓶中，加入100 mL含4%浓氨试液的80%甲醇（取浓氨试液4 mL，加80%甲醇至100 mL，摇匀即得），称定质量;然后以80 ℃水浴回流1 h，冷却后，再次称定质量，用含4%浓氨试液的80%甲醇补足损失的质量;抽滤，取50 mL滤液蒸干，残渣用80%甲醇复溶，转移到10 mL量瓶中，并以80%甲醇定容，摇匀;用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得[8]。

2.4 对照药材溶液的制备

取当归药材细粉和黄芪药材细粉各1 g，按“2.3”项下方法制备当归对照药材溶液和黄芪对照药材溶液。

2.5 HPLC指纹图谱的建立及分析

2.5.1 精密度试验取当归补血丸（S15）细粉适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图。结果，以32 号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD 为0.06%～0.23%（n=6）、相对峰面积的RSD 为0.97%～3.09%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验取同一批当归补血丸（S15）细粉适量，共称取6 份，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，以32 号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD为0.08%～0.09%（n=6）、相对峰面积的RSD为1.05%～2.54%（n=6），表明此方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验取当归补血丸（S15）细粉适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h 时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，以32 号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.07%（n=6）、相对峰面积的RSD为0.49%～2.57%（n=6），表明该供试品溶液在室温下24 h 内的稳定性良好。

2.5.4 指纹图谱生成及相似度评价取15 批当归补血丸样品细粉，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（其中检测波长为323 nm）进样分析，记录色谱图。将15 批样品的HPLC 图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》中，选择样品S1 的图谱作为参照图谱，经多点校正后，进行全谱峰匹配生成叠加指纹图谱，并以中位数法生成对照指纹图谱R（见图1）。以对照指纹图谱R为参照，对各样品的色谱图进行相似度评价。结果，在15 批样品的叠加指纹图谱中共发现33 个共有峰。与生成的对照图谱R比较，15 批样品色图谱的相似度在0.893～0.995 之间（见表1），表明15批样品的化学成分组成基本相同。

2.5.5 共有峰的指认和归属取当归对照药材溶液、黄芪对照药材溶液、“2.2”项下混合对照品溶液和“2.3”项下供试品溶液（S1），分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（见图2）。通过与混合对照品溶液色谱图进行比对，可指认出13 号峰为阿魏酸、15 号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷;通过与对照药材色谱图进行比对，可发现1～3、7、8、10、12、13（阿魏酸）、17～19、27～29、32、33 号峰归属于当归，14、15（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、20～23、25号峰归属于黄芪。

2.6 指标成分含量测定

2.6.1 专属性试验分别取“2.2”项下混合对照品溶液、“2.3”项下供试品溶液（S15）及空白溶剂（80%甲醇），按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（见图3）。结果显示，阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的保留时间分别为25.948、27.465、54.664 min，与相邻色谱峰的分离度均大于2.0，理论板数均大于80 000，且空白溶剂对测定无干扰，表明该方法的专属性良好。

2.6.2 线性关系及检测限、定量限考察分别取“2.2”项下混合对照品溶液0.8、1.0、1.5、2.5、5 mL 于5 mL 量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，然后按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以样品进样量（x）为横坐标，阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷以峰面积（y）为纵坐标、黄芪甲苷以峰面积对数值（lgy）为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归。结果，3种指标成分在各自进样量范围内线性关系均良好（r 为0.999 0～0.999 5）。取“2.2”项下混合对照品适量，以80%甲醇为溶剂进行逐级稀释，以信噪比10 ∶1、3 ∶1 分别得定量限和检测限。结果见表2。

2.6.3 精密度试验取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果，阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷峰面积的RSD分别为2.02%、2.15%、1.09%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.6.4 稳定性试验取“2.3”项下供试品溶液（S15），于室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h 时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，阿魏酸、毛蕊異黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷峰面积的RSD 分别为2.37% 、0.60%、0.49%（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h 内稳定性良好。

2.6.5 重复性试验取同一批样品（S15）6 份，每份约2.00 g，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并采用外标法计算含量。结果，阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的含量分别为0.093 6、0.361 9、0.915 9 mg/g，RSD分别为1.62%、2.99%、1.56%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.6.6 加样回收率试验精密称取已知含量的样品（S15）6 份，每份约1.00 g，分别按已知成分含量1 ∶1 的比例加入混合对照品溶液（按“2.2”项下方法制备），然后按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算其加样回收率。结果显示，阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的平均加样回收率分别为95.08%、100.96%、98.19%，RSD 分别为2.56%、2.93%、2.59%（n=6），表明该方法的准确度较好。结果见表3。

2.6.7 样品含量测定取15 批当归补血丸样品细粉，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并采用外标法计算3 种成分的含量。每批样品平行测定3 次，取平均值。结果显示，15 批当归补血丸样品中阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的平均含量分别为0.050 1、0.402 6、0.913 4 mg/g。B厂家各批次当归补血丸样品中黄芪甲苷的含量（0.891 2～0.940 0 mg/g）与A厂家样品（0.868 5～0.966 0 mg/g）基本没有差异，但B厂家各批次当归补血丸样品中阿魏酸含量（0.037 7～0.093 4 mg/g）明显高于A厂家样品（0.024 5～0.047 1 mg/g），且B厂家各批次当归补血丸样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量（0.335 3～0.424 2 mg/g）略低于A 厂家样品（0.261 6～0.535 6mg/g）。结果见表4。

3 讨论

3.1 样品提取方法及色谱条件的确定

在前期实验中，笔者考察了超声法和加热回流法对样品提取效果的影响。结果显示，采用加热回流法提取得到的成分较超声法更多，且各成分的提取率更高，故本研究采用加热回流法进行样品提取。本研究测定了阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷以及黄芪甲苷的含量，其中黄芪甲苷因紫外吸收弱，故采用ELSD检测器进行检测。当采用DAD 检测器对供试品溶液进行190～400nm全波长扫描时，发现在250 nm波长处毛蕊异黄酮葡萄糖苷的吸光度高，在323 nm 波长处阿魏酸的吸光度高，故本研究分别选择250、323 nm为检测波长。此外，与250 nm 波长处所得色谱图进行比较，在323 nm 波长处所得色谱图中共有峰数目较多、峰形较好，故本研究在进行指纹图谱分析时选择检测波长为323 nm。

3.2 当归补血丸指纹图谱与3种指标成分含量的分析通过前期调查，本课题组发现目前当归补血丸的在售厂家仅有2 家，故本研究仅选择上述2 个厂家的15 批样品进行分析。本研究建立了15 批当归补血丸样品的HPLC指纹图谱，其与对照指纹图谱R的相似度均大于0.89，表明15 批样品的化学成分组成基本相同。在15 批当归补血丸样品中，3 个指标成分的含量由高到低依次为黄芪甲苷（平均含量为0.913 4 mg/g）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（平均含量为0.402 6 mg/g）、阿魏酸（平均含量为0.050 1 mg/g）。其中，阿魏酸含量高于魏俊军[5]报道的结果（平均含量为0.037 3 mg/g）。本研究结果显示，2 个厂家生产的当归补血丸中黄芪甲苷的含量基本一致，但B 厂家大部分批次样品中阿魏酸含量均高于A厂家样品，A厂家样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量略高于B厂家样品。

综上，本研究建立了当归补血丸的HPLC指纹图谱及3 种指标成分的HPLC 定量分析方法，所建方法准确可靠、重复性好，可为当归补血丸质量标准的完善及其质量控制提供基础。