结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶的结晶方法

王炜，蒋雪松，张岱，吕莹

（1.河南中医药大学第一附属医院检验科，河南 郑州 450000；2.中国医学科学院病原生物学研究所，北京 100176）

结核分枝杆菌引起的感染性疾病仍然是全球关注的焦点。开发新型抗结核药物也愈加迫切[1]。目前研究已经在部分领域获得成果，如ATP 转运通道[2]及氨酰tRNA 合成酶（aminoacyl-tRNA synthe‐tase,aaRS）[3]抑制剂领域。由于aaRS 在蛋白质翻译过程中起着至关重要的作用，抑制这个酶家族的成员可导致蛋白质合成终止，达到抗菌和抗寄生虫的目的[4-7]，抑制tRNA 氨酰化是一种有效的抗结核分枝杆菌策略[8]。甲硫氨酰tRNA 合成酶（methionyltRNA synthetase,MetRS）与其他aaRS最大的区别是不同物种的MetRS 显示了结构的多样性[9]，适合特异性抑制剂的筛选，已被证明是理想的抗生素作用靶点。计算机辅助药物设计（computer-aided drug design,CADD）是目前临床前药物发现的一个关键方法[10-11]。获得结核分枝杆菌MetRS（Mycobacterium tuberculosisMethionyl-tRNA synthetase,MtMetRS）的晶体可以加快MtMetRS抑制剂的筛选。在本研究中探索无配体MtMetRS 的结晶条件和方法，旨在为基于MtMetRS结构的抑制剂筛选提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pQE60 质粒、M15 大肠杆菌，本实验室保存。高保真DNA 聚合酶、限制性核酸内切、T4 DNA 连接酶、DNA marker购自Takara公司。质粒提取、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。引物及基因合成、测序在瑞博兴科完成。青霉素、链霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自索莱宝公司。Milipure超滤管、PEG 8000、NaCl、醋酸钙等购自默克公司。HisPur Ni-NTA 树脂、蛋白质Marker 购自Thermo Scientific。ATP、精氨酸、宝石橙蛋白染色试剂（Sypro Orange）购自Merck公司。Sodium cacodylate和结晶筛选试剂盒购自Hampton Research公司。

1.2 方法

1.2.1 结晶蛋白的设计 根据GenBank 登录号CP003248.2 核酸序列，由公司合成结核分枝杆菌MetRS（MtMetRS）基因。本研究设计了4 种重组蛋白 序 列：（1）在MtMetRS 氨 基 端 加 上6×His 序 列（nHisMtMetRS）；（2）在MtMetRS 羧基端加上6×His序列（cHisMtMetRS）；（3）在MtMetRS 氨基端加上6×His 序列和thrombin 酶识别序列（MtMetRS）；（4）在MtMetRS 氨基端和羧基端分别加上6×His 序列（dMtMetRS）。图1 为重组蛋白一级结构示意图，在MtMetRS 序列中引入thrombin 酶识别序列，在重组蛋白纯化时通过thrombin 切除6×His 序列，获得天然长度的MtMetRS 蛋白。使用PCR 在MtMetRS 基因两端引入各种结构序列后连接入pQE60 的多克隆位点。连接产物转化DH5α大肠杆菌，37 ℃过夜培养。使用菌落PCR 鉴定阳性克隆后送公司测序，确认插入基因开放读码框是否正确。

图1 重组蛋白一级结构示意图Figure 1 Schematic diagram of the primary structure of recombinant protein

1.2.2 重组MtMetRS的制备 pQE60-MtMetRS重组质粒转化M15 大肠杆菌。挑取pQE60-MtMetRS/M15 单菌落接种到50 mL LB 培养基中37 ℃震荡培养12 h。第2 天将培养物以1∶50 接种到4 L LB培养基中扩大培养。菌液浓度为A6000.8 时加入终浓度1 mmol/L IPTG，18 ℃过夜诱导MtMetRS 表达。诱导后的菌液高速离心收集菌液重悬于含有500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF 的裂解缓冲液中，超声裂解后15000g离心45 min 去除未破碎的细菌及不溶性颗粒，可溶性部分用Ni-NTA 树脂结合。依次使用含有100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF缓冲液洗涤树脂，20 mL 含20 mmol/L 咪唑的相同缓冲液洗涤。无标签蛋白使用thrombin 酶切掉6×His 序列。含有6×His 结构的重组蛋白使用20 mL 含300 mmol/L 咪唑的缓冲液从树脂上洗脱结合的重组蛋白。截留相对分子质量为30000 的超滤管浓缩洗脱液到1.5 mL。浓缩液注入Äkta 层析仪中，100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0缓冲液进行色谱分离。SDS-PAGE蛋白电泳分析蛋白纯度和蛋白分子量。超滤管浓缩重组蛋白，Nanodrop 调整蛋白浓度到10 mg/mL。重组蛋白50 μL 分装后液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 不同序列MtMetRS 活性验证 100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0 缓 冲 液 稀 释SYPRO Day 到10×。将纯化的不同序列的MtMetRS 重组蛋白稀释到20 μmol/L，与5 mol/L 的ATP、甲硫氨酸按照1∶1（体积比）混合，在冰上孵育15 min，然后与10×SYPRO Day 按照1∶1（体积比）混合后冰上孵育15 min。MtMetRS 终浓度为5 μmol/L，SYPRO Day终浓度为5×Bio-Rad 的CFX 实时定量PCR 仪设置加热程序，加热温度范围10～90 ℃。从20 ℃起始，每次加热时间为1 min，加热后温度升高0.5 ℃。使用CFX qPCR 仪的Cal Gold540 通道检测SYPRO Day荧光信号。

1.2.4 晶体初步筛选 从-80 ℃冰箱取出保存的重组蛋白，于手中融化后放到冰上备用，结晶时蛋白质浓度调整为7.5 mg/mL。采用坐滴气相扩散法筛选MtMetRS结晶条件。具体操作如下：在96孔结晶板的池液孔中加入80 μL 结晶液，在座滴孔中使用分配器加入0.8 μL 蛋白溶液，使用多通道移液器从池液孔中吸取0.8 μL池液加入座滴孔中。结晶蛋白与池液以1∶1 混合。加样完的96 孔板放置20 ℃恒温室进行晶体生长。

1.2.5 晶体优化 蛋白质晶体优化与生产过程采用悬滴法。依据初筛结晶条件，分别调整沉淀剂浓度、缓冲液pH 值、盐浓度，配置结晶缓冲液1 mL。蛋白点样时，在池液孔中加入250 μL 结晶缓冲液。在硅化玻片上以1 μL 重组蛋白，并加入1 μL 池液，混匀后覆盖在池液孔上，并密封好。放入20 ℃恒温室进行晶体生长。根据晶体生长情况选择结晶条件，在新的结晶条件下加入20%Hampton Research的Additive Screen试剂进一步进行筛选。

1.2.6 晶体衍射实验 定期观察晶体生长，选择体积较大的晶体，用针剥离片状晶体后，使用loop 环从液滴中捞取单晶，并迅速放入液氮中冷冻。冷冻好的晶体一直在液氮中保存。数据的采集在同步辐射光源进行。晶体采集策略为，每旋转0.5 度采集一张衍射图，收集360度以上的数据，直到晶体被X射线损坏。晶体被X射线损坏的特点是晶体的分辨率降低。使用open-source pymol 2.5 分析MtMetRS分子间的作用。

2 结果

2.1 重组蛋白的制备

不同序列的重组蛋白纯化结果如图2所示。设计的不同序列重组蛋白均以可溶形式存在。尺寸排阻色谱的洗脱峰成高斯分布，提示重组蛋白分子均一。图中标准品曲线的洗脱峰的相对分子质量依次是670000、158000、44000、17000、1.35000。单6×His 序列和双6×His 序列对获得均一可溶的MtMetRS重组蛋白没有影响。

图2 使用分子筛纯化不同序列的重组蛋白Figure 2 Purification of recombinant proteins with different sequences using size exclusion chromatography

2.2 不同序列蛋白活性TSA分析

为了验证制备的重组MtMetRS 活性，使用Thermal Shift Assay（TSA）分析重组蛋白与天然底物及类似物的结合能力，结果如图3 所示。各种序列MtMetRS 与天然底物ATP、Met 混合后可以使重组蛋白的热变性温度升高3 ℃。这提示各种序列的MtMetRS均可以催化天然底物生成AMP-Met，而增加蛋白质的热稳定性。在羧基端和氨基端添加的6×His氨基酸序列不影响蛋白质的天然催化能力。

图3 使用TSA分析重组蛋白质的活性Figure 3 Activity of recombinant protein analyzed by TSA

2.3 不同构建蛋白晶体初筛结果

不同构建重组蛋白生长出晶体的时间不同、结晶条件也不同。不含6×His结构的重组蛋白没有筛选到结晶条件。氨基端6×His 结构的重组蛋白、羧基端6×His 结构的重组蛋白及双6×His 结构的重组蛋白均筛选到结晶条件。不同构建筛选到的晶型在100 倍镜下的形态如图4 所示。图4A 显示的为羧基端6×His 结构的重组蛋白的晶体类型。图4B显示的为氨基端6×His 结构的重组蛋白的晶体类型。单6×His 结构的重组蛋白晶体以绒球、针状及微晶形式存在。氨基端的6×His 结构可以帮助MtMetRS 分子形成较好的晶型。图4C 显示的为两端均标记6×His 的MtMetRS 的晶型。双6×His 结构的重组蛋白筛选到结晶条件最多，可以看到有折光性晶体，外形好于其他结构的晶体。

图4 不同重组蛋白晶体初筛结果Figure 4 Preliminary screening results of different recombi‐nant protein crystals（100×）

2.4 蛋白晶体优化结果

从初筛结果中挑选晶型较好的结晶条件进行优化。单6×His结构的重组蛋白在优化的结晶条件下没有发现晶型的变化，双6×His 结构的重组蛋白优化晶型发生明显变化。在低浓度沉淀剂的条件下，晶体的生长时间延长，晶体的外形锐利。初次优化后由于晶体成片簇状，为了进一步调整晶型本研究使用Hampton Research 公司的Additive Screen试剂进行再次优化，最终的优化结果如图5所示，晶体成片状叠加，体积较之前增大。

图5 优化后的dHisMtMetRS晶体Figure 5 Optimized dHisMtMetRS crystal（400×）

2.5 晶体的衍射试验结果

晶体衍射实验结果如图6 所示，衍射实验的光源波长为1Å，MtMetRS 的衍射点清晰，晶体的分辨率为1.95Å，总共收集到900张衍射图。该晶体属于P1 群，每一个晶胞内有2 个分子。使用open-source pymol展示了MtMetRS氨基端和羧基端柔性链在晶体内的作用。图7A 展示的是dHisMtMetRS 羧基末端柔性链在晶体的位置，黄色MtMetRS 分子的羧基端链为橘红色，位于周围绿色分子堆积形成的孔洞中，这一端链缺少6×His 序列的电子密度信息。图7B 展示的是MtMetRS 分子氨基端链在晶体分子间的作用。黄色分子的氨基端6×His链搭在邻近绿色分子的α4 与α5 螺旋上，并形成盐桥，对固定分子起到帮助作用。

图6 dHisMtMetRS晶体衍射图Figure 6 Diffraction pattern of dHisMtMetRS crystal

图7 6×His结构在分子堆积中的作用Figure 7 Role of 6×His sequences in molecular stacking

3 讨论

MtMetRS 是很好的抗结核药物设计的靶分子。一系列病原生物的MetRS 抑制剂已经研究出来，并显示出良好的体外抑制效果。获得MtMetRS 的晶体结构是快速、准确的筛选抑制物的前提，也是基于分子结构药物设计的前提。华盛顿大学经过多年的努力突破重组蛋白的制备问题并获得MtMetRS 与天然底物的复合物晶体结构，但最终并没有获得无配体MtMetRS 的晶体结构。本研究发现一种借助蛋白质两端His 标签进行结晶的方法，最终获得MtMetRS无配体晶体。

蛋白质结晶是一个复杂的过程，每种蛋白质的电荷、亲疏水特性均不相同。现在还没有一个统一的结晶方法。通常使用商业的试剂盒筛选结晶溶液条件。但是传统的蛋白质结晶手段对获得无配体MtMetRS结晶不起作用。没有6×His结构的天然MtMetRS 分子无法结晶，而含有6×His 结构的重组蛋白均筛选到结晶条件，这一现象提示6×His 结构是获得无配体蛋白晶体的关键。尽管有报道6×His结构影响蛋白质结晶[12]，但在无配体MtMetRS 结晶过程中起到至关重要的作用。

通常破坏蛋白质分子周围的水化膜，使分子在疏水作用下有序堆积，是形成晶体的主要原因。分析无配体MtMetRS 晶体晶胞内分子之间的作用，可以看出氨基端6×His 作为柔性链，可以和另一分子的α4与α5结构形成盐桥，在2个蛋白质分子间形成作用力。这种分子间作用力可以破坏分子表面的水化膜，从而促使分子堆积在一起形成晶体。羧基端6×His缺少电子密度图不能明确其具体的空间位置。但从目前的电子密度图信息提示可能与邻近晶胞分子有相互作用。氨基端6×His重组蛋白产生的晶体质量比羧基端6×His 重组蛋白好，提示氨基端6×His形成的晶胞内作用力是产生晶体的主要因素，羧基端6×His 与不同晶胞分子的作用力也是结晶的必要条件。x 射线衍射实验结果清晰地显示出衍射点，这提示以这种方式进行的分子堆积是有序的，不是分子间的杂乱堆积。

在蛋白质晶体学领域中没有适用于所有蛋白质结晶的方法学，每一种蛋白质均需要寻找结晶方法。本文详细介绍了MtMetRS 的结晶方法，为基于晶体结构筛选、设计MtMetRS 抑制剂提供了方法及数据支持，将加快MtMetRS的研究进程。