鬼臼苦素诱导Ph+慢性髓系白血病细胞焦亡及其相关分子机制研究

陈丽丽，廖芬芳，陈向洁，刘漫宇，王伟章

（1.广东药科大学附属第一医院药物临床试验机构办公室，广东 广州 510080；2.广东药科大学生命科学与生物制药学院/广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006）

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种严重威胁人类健康的恶性增殖性疾病。尽管酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的发现及应用使得费城染色体阳性慢性髓系白血病(Ph+CML)的疗效显著改善，然而，该类靶向治疗药物仍然不能彻底治愈该疾病[1]。因此，探索和开发新型的Ph+CML 治疗药物和方法仍然十分必要。鬼臼苦素(picropodophyllin,PPP)是从我国传统中药鬼臼中提取出来的活性物质，具有安全、低毒、高效的体内外抗肿瘤活性。以往的研究发现，PPP 能有效诱导CML 原代细胞及细胞系发生细胞凋亡，以及抑制细胞系的克隆形成[2]。最近，Liao 等[3]通过CML 小鼠模型的研究也发现，PPP可以通过激活p53蛋白抑制小鼠CML干细胞的增殖并显著延长小鼠的生存时间。这些结果表明PPP具有应用于CML 临床治疗的潜力。细胞焦亡(pyroto‐sis)作为一种新的促炎程序性细胞死亡方式，与细胞凋亡在细胞形态学改变和发生机制上都有明显区别，在肿瘤化疗中发挥重要作用[4]。然而，迄今尚无关于PPP 对CML 细胞焦亡作用影响的研究。因此，进一步探索PPP的作用机理将为其在CML临床治疗的应用提供理论基础。本研究拟采用PPP 作用于Ph+CML 细胞系Ku812 和K562，通过流式细胞术检测细胞死亡，通用Western blot检测凋亡、焦亡和坏死性凋亡以及Bcl-2家族相关蛋白表达的影响，初步探讨PPP体外对Ph+CML细胞焦亡的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 人Ph+CML细胞系K562 和Ku812均购自中国科学院上海分院细胞库。细胞培养在含10%（φ）胎牛血清的1640 培养液（含10%青/链霉素）中，置于5%（φ）CO2的37 ℃培养箱。

1.1.2 主要仪器 流式细胞仪（美国BD 公司，型号：FACScalibur）；电泳仪（美国Bio-Rad，型号：PowerPac Basic）；CO2细胞培养箱（美国Thermo，型号：3534）。

1.1.3 主要试剂 RPMI-1640 培养液、胎牛血清（FBS）、青/链霉素混合液（双抗）、ECL 和蛋白提取试剂盒及蛋白酶抑制剂购自Thermofisher 公司；DMSO溶液购自Sigma（作为溶剂，终浓度为0.1%）；Annexin V-Alexa 647（640912）/碘化丙啶（421301；Propidium Iodide，PI）购 自Biolegend 公 司；PPP（S7668）（溶于DMSO，母液5 mmol/L）和Q-VDOPh（S7311；Quinoline-Val-Asp-Difluoro-phenoxyme‐thylketone，QVO）（溶于DMSO，母液8 mmol/L）购自selleck 公司；GAPDH 抗体购自Proteintech 公司；Bcl-2（#4223）、Caspase-3（#9662）、Caspase-7（#9492）、Cleaved-Caspase-9（#9505)、MLKL（#14993）和Phospho‐MLKL（S358）（#91689）、Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP；#9542）、Bak（#12105）、MCL-1（#5453）、Bcl-2（#15071）、Bcl-xl（#2764）抗体和辣根过氧化物酶标山羊抗兔（#7074）以及羊抗小鼠IgG（#7076）均购自CST 公司。DFNA5/GSDME（ab215191）和Noxa（ab13654）抗体购自abcam 公司。Bax（PA5-78857）抗体购自Thermofisher公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞凋亡检测 以终浓度为0.5、1.0、5.0 μmol/L 的PPP 处理K562 和Ku812 细胞48 h；或者Caspase泛抑制剂QVO（8.0 μmol/L）预处理Ku812细胞2 h 后再加PPP 处理48 h。处理完成后收集细胞，冰浴1×PBS 润洗2 次，离心去上清，加入100 μL 1×binding buffer 重悬，再加入4 μL Alexa Flour 647 Annexin-V 试剂，混匀，室温避光孵育10 min。再加入7 μL PI，最后加入1× binding buffer 200 μL 调整细胞数为1×106/mL，上机检测。

1.2.2 Western blotting 分析 以终浓度为0.5 和1.0 μmol/L 的PPP 处理细胞24 h 后，收集细胞并提取总蛋白检测以下蛋白：Caspase-3、c-Caspase-9、Caspase-7、PARP、DFNA5、MLKL 和p-MLKL。终浓度为0.5、1.0和5.0 μmol/L的PPP处理细胞不同时间（6、8、10、12、18 和24 h）后，收集细胞并提取总蛋白检测以下蛋白：Bak、Bax、Noxa、Bcl-2、Bcl-xl 和Mcl-1。样品经SDS-PAGE电泳分离，冰上湿转1.5 h至PVDF膜，室温条件下5%脱脂奶粉封闭2 h，加入含5% BSA 稀释液稀释的相应抗体（1∶1000），4 ℃过夜，加入相应的稀释二抗（1∶5000），室温孵育1 h。洗膜后用ECL solution显色，最后进行显影，定影。

1.2.3 统计分析 采用Graph Prism8.0 软件包进行数据分析，实验数据用表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPP诱导Caspase依赖性的细胞死亡

在Ku812 细胞中，3 种浓度的PPP（0.5、1.0 和5.0 µmol/L）均诱导细胞发生显著的死亡（Annexin V+细胞）；在K562 细胞中，1.0 和5.0 µmol/L 的PPP诱导细胞发生明显的死亡（Annexin V+细胞），而0.5µmol/L对细胞死亡无明显影响（图1）。相同浓度的PPP 作用下，Ku812 细胞的死亡率显著高于K562细胞（图1）。Caspase泛抑制剂QVO预处理Ku812细胞后，明显地抑制PPP诱导细胞发生的死亡（图2）。

图1 FACS检测PPP对Ku812和K562细胞死亡的影响Figure 1 Effect of PPP on Ku812 and K562 cell death analyzed by FACS

图2 FACS 检测Caspase 泛抑制剂QVO 对PPP 诱导细胞死亡的影响Figure 2 Effect of QVO on PPP-induced cell death analyzed by FACS

2.2 PPP 对凋亡、焦亡和坏死性凋亡相关蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，不同浓度的PPP（0.5 和1.0µmol/L）处理Ku812 细胞24 h 后，凋亡相关的活化Caspase 蛋白c-Caspase-3、c-Caspase-7 及其底物c-Caspase-9 和c-PARP 蛋白水平均明显升高，而焦亡相关蛋白DFNA5/GSDME 同样出现活化的N-DFNA5/GSDME 蛋白，但坏死性凋亡蛋白MLKL发生下调，其磷酸化蛋白p-MLKL 未发生变化；K562细胞在相同剂量PPP的作用后，上述蛋白均未发生明显的表达或活性改变（图3）。

图3 Western blot检测PPP 对凋亡、焦亡和坏死性凋亡相关蛋白表达的影响Figure 3 Effect of PPP on the expression of apoptosis，pyrotosis and necroptosis associated proteins

2.3 PPP对Bcl-2家族蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，不同浓度的PPP（0.5、1.0 和5.0 µmol/L）处理Ku812 细胞不同时间后，促凋亡蛋白Bak 蛋白水平在处理6、10 和18 h 后发生上调，而在其他时间点未发生变化；促凋亡蛋白Bax和Noxa 以及抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-xl 和Bcl-2 在所有处理时间点均未发生明显变化（图4A）。在K562细胞中，不同浓度PPP处理18 h和24 h后，抗凋亡蛋白Mcl-1 蛋白水平发生下调，在其他时间点未发生变化；抗亡蛋白Bcl-2 在PPP 处理24 h 后发生下调，在其他时间点未发生变化；Bak、Bax和Noxa在所有处理时间点均未发生明显变化（图4B）。

图4 Western blot检测PPP对Bcl-2家族蛋白表达的影响Figure 4 Effect of PPP on the expression of Bcl-2 family proteins assayed by Western blot

3 讨论

尽管BCR-ABL 融合基因是Ph+CML 发病的根源，但CML 异质性明显，基因学特征复杂，TKI单药治疗仍无法治愈该疾病[5]。因此，迫切需要寻找新的治疗药物和策略。以往的研究已经发现，PPP 在体内外均能有效诱导CML 细胞系及CML 干细胞凋亡，以及抑制细胞系的克隆形成。本研究发现PPP 能通过DFNA5 介导CML 细胞发生焦亡，这表明PPP能够通过多种机制发挥抗CML作用，将为其在CML临床治疗中的应用提供重要的理论依据。

细胞死亡途径多种多样，包括细胞坏死、凋亡、坏死性凋亡、自噬、铁死亡和细胞焦亡等，它们具有不同的形态和生化特征相关[6]。在本研究中，通过Annexin V/PI 双染法及FACS 检测细胞死亡的结果显示，K562 及Ku812 细胞在PPP 作用后均出现明显的Annexin V 单阳性及Annexin V/PI 双阳性细胞群，这表明PPP 能够有效诱导CML 细胞发生死亡。然而，Annxin V 阳性细胞并不是细胞凋亡所特有的，细胞发生坏死性凋亡及焦亡等死亡时同样会出现此情况。因此，进一步通过Western blot的方法检测与细胞凋亡、焦亡及坏死性凋亡相关蛋白的表达及活性情况。在坏死性凋亡过程中，RIPK1、RIPK3和MLKL 是参与坏死性凋亡的主要分子。MLKL作为RIPK1 和RIPK3 下游的效应蛋白发挥作用。MLKL 在Ser358 位点被活化的RIPK3 磷酸化会诱导MLKL 寡聚化并向质膜转位，并与磷脂酰肌醇相互作用，诱导膜通透和细胞破坏而发生坏死性凋亡[7-8]。Western blot 检测结果显示，K562 及Ku812细胞在PPP 作用后MLKL 磷酸化水平未发生变化，相反，其总蛋白水平在Ku812 出现表达下调，这说明PPP 并未通过MLKL 介导的途径诱导CML 细胞发生坏死性凋亡。细胞焦亡的特征是当细胞受到刺激后，胞内炎性小体激活Caspase 进而切割Gasdermin（GSDM）蛋白家族导致细胞发生炎症性死亡[9]。有研究发现，GSDMD 是细胞焦亡的执行蛋白，该蛋白被活化的Caspaes-3 裂解产生NGSDMD促进肿瘤细胞发生焦亡[10]。近期大量研究证明，DFNA5/GSDME同样可以被活化的Caspase-3切割产生N-DFNA5/GSDME 诱导细胞焦亡，然而当Caspase-3 被活化时，DFNA5 的表达水平则决定了细胞不同的死亡方式。当细胞内DFNA5/GSDME高表达时，Caspase-3 切割DFNA5/GSDME 发生细胞焦亡现象；当DFNA5/GSDME 低表达或者不表达时，则发生细胞凋亡现象[4]。本研究发现，PPP 可引起Ku812 细胞中Caspase-3 活化及N-DFNA5/GSDME 蛋白水平的提高，表明PPP 的确诱导CML细胞发生焦亡。同时，结果也显示凋亡相关的Caspase-7 同样发生活化并作用于底物PARP诱导其发生切割，促进细胞凋亡。上述结果表明，PPP在体外能够通过诱导细胞焦亡的方式杀伤CML 细胞。PPP 在体内是否同样具有诱导CML 细胞焦亡的作用有待进一步的研究。

众所周知，Bcl-2蛋白家族通过控制线粒体通透性进而影响Caspase 家族蛋白活性来调节细胞凋亡[11]。其中，Bak 和Bax 是线粒体膜通透的主要执行者。在受到BH3-only 蛋白激活后，Bak 和Bax 能够形成多聚体，并引起线粒体外膜的穿孔，从而诱导细胞色素C 等物质的释放，激活Caspase 级联反应，导致细胞死亡的发生[12-13]。因此，为了进一步了解PPP是如何活化Caspase进而切割DFNA5诱导细胞焦亡，本研究通过Western blot 的方法检测了K562 及Ku812 细胞在PPP 作用后Bcl-2 家族蛋白的表达情况。结果显示，在Ku812 细胞中只有促凋亡蛋白Bak表达发生上调，而K562细胞中的抗凋亡蛋白Mcl-1 和Bcl-2 表达发生下调。以往的研究发现，PPP 诱导p53 基因野生型的结直肠癌细胞系发生凋亡主要是通过促凋亡蛋白Bad介导的线粒体凋亡通路[14]。由于在相同浓度的PPP 作用下，Ku812 细胞的细胞死亡比例明显高于K562 细胞，因此，推测在PPP促发细胞死亡的过程中促凋亡蛋白表达上调可能在介导Caspase 家族活化方面比抗凋亡蛋白表达下调发挥着更为重要的作用。

综上所述，本研究发现PPP 可能通过上调促凋亡蛋白Bak 表达，进而活化Caspase-3 并诱导焦亡相关蛋白DFNA5/GSDME 的切割，从而导致CML 细胞发生焦亡。该研究进一步阐明了PPP 抗CML 的机理，为将PPP 开发成为治疗Ph+CML 药物提供了理论依据。