冬虫夏草提取液有效成分分析及其在卷烟中的应用研究

田数，柴颖，田大勇，董露，王非易，高铎，李力群，张峻松

1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.内蒙古昆明卷烟有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010020；3.内蒙古烟草质量监督检测站，内蒙古 呼和浩特 010010

0 引言

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)为麦角菌科虫草属真菌，是由冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的复合体，冬虫指蝙蝠蛾科幼虫尸体，夏草指冬虫夏草菌形成的子座。我国优质天然冬虫夏草多产于海拔3000～5100 m的高原高山草甸区[1-5]，青海、西藏、四川、云南等地为其主要产地。冬虫夏草为传统名贵药材，药用历史悠久，传统中医学认为其具有止血、益肺、补气血等功效，现代药理学还证明其具有抗癌抗肿瘤、护肝、增强人体免疫系统活性、抗炎、抗氧化、调节心脑血管机能等功效[6-9]。具体来说，冬虫夏草中的多糖类和糖醇类物质(如虫草多糖、虫草酸等)具有抗肝纤维化、降血糖、清除自由基和抗肿瘤作用[10-12]。热裂解-气相色谱质谱联用技术可通过对卷烟燃烧过程的模拟，实现对裂解产物的在线分析，在烟草研究领域得到了广泛的应用[13-16]。目前研究者多关注冬虫夏草的有效成分在药理学方面的功效[17-20]，而鲜见有关冬虫夏草提取液中的香味成分分析及其特征成分在卷烟中的热裂解行为的研究。

基于此，本文拟采用气相色谱-质谱联用法对冬虫夏草提取液香味成分组成进行分析，应用热裂解-气相色谱-质谱联用仪(Py-GC-MS)对特征成分虫草酸和虫草多糖裂解产物进行定性、定量分析，并按照中式卷烟的风格评价方法明确香味成分特征及其对卷烟感官品质的贡献，以期为进一步研究冬虫夏草特征成分在卷烟中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

主要材料：冬虫夏草粉、空白卷烟叶组，内蒙古昆明卷烟有限责任公司提供。

主要试剂：乙酸苯乙酯(纯度>98%)，购于北京百灵威科技有限公司；乙醚、丙酮、无水乙醇、二氯甲烷，均为分析纯，购于北京化工厂。

主要仪器：8890B/5977B型气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，美国安捷伦科技有限公司产；Frontier-EGAPY 3030 D型多功能高温热裂解仪(Py)，日本Frontier LAB公司产；BSA323 S型电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产。

1.2 实验方法

1.2.1 冬虫夏草提取液香味成分分离与分析

1)冬虫夏草提取液制备

精确称取2.000 0 g冬虫夏草粉末加入10 mL 75%(体积分数，下同)的乙醇溶液，在120 ℃条件下回流提取3 h，离心过滤，提取2次，合并滤液，用75%的乙醇溶液定容至50 mL，得到冬虫夏草提取液。

2)香味成分分离

称取5 g冬虫夏草提取液于1000 mL三口圆底烧瓶中，加入350 mL蒸馏水和30 g氯化钠，圆底烧瓶一端连接自行设计的同时蒸馏萃取装置。同时蒸馏萃取装置的另一端连接浓缩瓶，浓缩瓶中加入60 mL二氯甲烷，在60 ℃的水浴中同时蒸馏萃取2.5 h，结束后，在浓缩瓶中加入1 mL内标乙酸苯乙酯(0.275 mg/mL)溶液。将萃取液转移至旋转蒸发仪，浓缩至1.0 mL，移至色谱瓶中进行进样分析。

3)香味成分分析

色谱条件：色谱柱HP-5 MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度280 ℃，进样量1 μL，分流比5∶1，载气He(1.0 mL/min)，升温程序为50 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min的速率升温至280 ℃，保持20 min。

质谱条件：传输线温度280 ℃，四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，EI源电子能量70 eV，质量扫描范围30～550 amu。

1.2.2 冬虫夏草特征成分的分离纯化

1)虫草酸的分离纯化

精确称取2.000 0 g冬虫夏草粉末，在粉末中加入20 mL 95%的乙醇溶液，90 ℃水浴回流提取1 h，过滤提取2次，合并滤液，得冬虫夏草乙醇提取液(保留该过程产生的冬虫夏草乙醇提取滤渣，用于虫草多糖提取)；将冬虫夏草乙醇提取液减压浓缩至原体积的1/5，然后将浓缩液静置至室温，冷却，沉淀析出，离心，沉淀物真空干燥，得到虫草酸粗品。

精确称取一定量的虫草酸粗品，加入10倍质量的蒸馏水，磁力搅拌至其完全溶解，2000 r/min转速离心10 min，取上清液，将上清液与有机溶剂(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)按 3∶1的体积比混合，装入分液漏斗中，剧烈振荡20 min，静置，取上清液。上清液按Sevag法重复脱蛋白，直至水相和氯仿相之间无明显的蛋白沉淀为止。水相加入5倍体积的无水乙醇，放入冰箱中，静置过夜，有白色晶体析出；过滤，沉淀用无水乙醇洗涤3次，干燥即得除蛋白虫草酸。

精确称取一定量的除蛋白虫草酸样品，加入10倍质量的50%乙醇溶液，加热并磁力搅拌，使其全部溶解，然后冷却至室温，静置2 h以上，过滤，用无水乙醇洗涤沉淀3次，干燥即得虫草酸纯品，气相色谱检测其纯度为98.52%。

2)虫草多糖的分离纯化

在冬虫夏草乙醇提取滤渣中加入一定量的水，在80 ℃水浴条件下浸提3 h，过滤，浸提2次，合并滤液并浓缩，然后向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇以沉淀多糖，静置2 h以上。过滤，沉淀依次以乙醚、丙酮、无水乙醇洗涤，脱水干燥即得虫草多糖粗品。

将所得虫草多糖粗品用20倍质量的蒸馏水溶解，所得溶液与有机溶剂(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)按 3∶1体积混合，装入分液漏斗中，剧烈振荡20 min，静置取上清液。上清液按Sevag法重复脱蛋白，直至水相和氯仿相之间无明显的蛋白沉淀为止。水相加入4倍体积的无水乙醇以沉淀多糖，静置2 h以上，过滤，沉淀用无水乙醇洗涤3次，干燥即得虫草多糖纯品，利用硫酸-苯酚法测定其纯度为95.39%。

1.2.3 冬虫夏草特征成分的热裂解分析

1)虫草酸和虫草多糖的热裂解条件

卷烟热解蒸馏区的温度约为200～900 ℃，大部分烟气成分产生于该温度区间，因此借鉴以往经验分别选择300 ℃、600 ℃、900 ℃对冬虫夏草的特征成分进行热裂解分析。称取一定量的虫草酸纯品和虫草多糖纯品，放置于多功能高温热裂解仪样品杯中，按照设定的热裂解条件进行热裂解。热裂解条件为：裂解温度300 ℃、600 ℃、900 ℃，持续时间10 s，初始温度30 ℃，升温速率20.00 ℃/ms，载气为氮气。

2)热裂解产物分析条件

将多功能高温热裂解仪与GC-MS串联，构成热裂解-气相色谱-质谱分析系统，对虫草酸和虫草多糖的裂解产物进行分析。

气相色谱条件：进样口温度为280 ℃，进样量为1 μL，分流比为10∶1，载气为氦气，气相色谱柱选用型号为DB-5 MS的弹性石英毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，气相色谱升温程序为50 ℃,保持2 min，以4 ℃/min的速率升温至280 ℃,保持10 min。

质谱检测条件：传输线温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，EI源电子能量为70 eV，电子倍增器电压为1600 V，质量扫描范围为30～550 amu。

用WILEY和NIST标准质谱库对热裂解产物挥发性成分进行定性分析，并采用面积归一化法测定其含量。

1.2.4 感官评价方法将冬虫夏草提取液用20%乙醇溶液稀释成1%(体积分数)的稀释液。取空白卷烟叶组100 g，按照卷烟工艺要求用量，定量移取冬虫夏草稀释液，采用医用喷雾器，将冬虫夏草稀释液均匀喷洒在叶组中，作为实验组。对照组的卷烟叶组样品采用相同体积的乙醇溶液(体积分数为20%)进行处理。将处理后的烟组样品密闭贮存约4 h，采用低温处理将烟叶烘干后，手工制成卷烟。将卷制好的样品卷烟按照《卷烟 第4部分：感官技术要求》(GB 5606.4—2005)[21]的规定，单层放置在(22±2) ℃、相对湿度(60±2)%的恒温恒湿箱内48 h，将水分含量平衡至(12±1)%。

由7名内蒙古昆明卷烟有限责任公司评吸委员会评委对平衡好的卷烟进行感官评价，按照中式卷烟的风格评价方法[22]进行评价。

2 结果与讨论

2.1 冬虫夏草提取液香味成分分析

对冬虫夏草提取液香味成分进行分析，结果如表1所示。由表1可知，冬虫夏草提取液中的香味成分种类较多，主要有丁二酮、乳酸乙酯、γ-丁内酯、丁酰乳酸丁酯、椰子醛等成分，这些香味成分可明显提升和丰富卷烟的奶甜香韵。此外，提取液中的苯乙醇具有新鲜面包香、清甜的玫瑰样花香，可增加卷烟烟气的回甜感；辛酸乙酯具有白兰地酒和菠萝样香气，具有柔和烟气、增补烤烟特征香的作用；壬酸乙酯具有油脂、水果和白兰地酒样香气，可使烟气柔和细腻。嗅觉评价结果表明，冬虫夏草提取液香韵丰富，主要以奶甜香为主，辅以甜香、果香、酒香等香韵。

表1 冬虫夏草提取液香味成分分析结果Table 1 The analysis results of the aroma components in the extract of Cordyceps sinensis extract

2.2 虫草酸的热裂解产物分析

虫草酸热裂解产物分析结果如表2所示。由表2可以看出，虫草酸在热裂解过程中生成了酯类、醛酮类、醇类、酸类、杂环类等物质，这些物质呈现出花香、酒香、青香、烤香、果香、甜香等多种香韵，对于塑造卷烟风味、提升卷烟品质具有重要作用。裂解产物的种类随着裂解温度的升高而增加，裂解温度为300 ℃时共检出化合物23种，占总峰面积的81.95%，含量最高的物质为棕榈酸(16.82%)，其次是棕榈酸-s-丁酯 (13.76%)和月桂酸(7.92%)；当裂解温度为600 ℃时共检出化合物16种，占总峰面积的42.70%，检测到含量最高的是β-D-呋喃半乳糖酯(18.18%)，其次是5-甲基噻唑(3.42%)、山梨醇(3.23%)和月桂酸(3.23%)；当裂解温度为900 ℃时，共检出化合物18种，占总峰面积的98.05%，主要组分为碳水化合物，其中裂解产物含量最高的仍为β-D-呋喃半乳糖酯(23.85%)，其次是1,4-酐-D-葡萄糖醇(14.40%)和月桂酸(12.01%)。

表2 虫草酸热裂解产物分析结果Table 2 The analysis results of the pyrolysis products of cord yceptic acid

2.3 虫草多糖的热裂解产物分析

虫草多糖的热裂解产物分析结果如表3所示。由表3可知，虫草多糖在热裂解过程中可以释放出小分子的脱水单糖和小分子的醛、酮类物质，其中D-阿洛糖出现比例均较高，D-阿洛糖是葡萄糖的C3差相异构体，说明在卷烟燃吸时D-阿洛糖有可能会转移至主流烟气中，为改善卷烟的甜味提供一定的帮助。在300 ℃条件下进行热裂解，共检测出化合物22种(匹配度大于80%)，含量最高的为D-阿洛糖，其次为1,6-脱水-β-D-葡萄糖；在600 ℃裂解温度下，共检出化合物41种(匹配度大于80%)，含量最高的也为D-阿洛糖，其次为1,4-脱水-甘露醇；在900 ℃裂解温度下，共检出化合物50种，含量最高的仍为D-阿洛糖，其次为1,5-脱水-D-半乳糖醇。从裂解产物中亦可以推断出虫草多糖的结构中有较多的葡萄糖、甘露糖、半乳糖醇单元。

表3 虫草多糖热裂解产物分析结果Table 3 The analysis results of the pyrolysis products of cordyceps polysaccharide

表3(续)

2.4 冬虫夏草提取液对卷烟风格的影响

冬虫夏草提取液制备的卷烟样品感官评价结果如表4所示,其中香气风格各项指标通过嗅香和评吸确定得分，分值分别为0～3分、0～10分；口味风格、舒适感特征、烟气特征各项指标仅通过评吸确定得分，分值分别为0～5分、0～10分、0～10分。由表4的结果可知，冬虫夏草提取液对卷烟香气风格的影响主要表现为：可使奶香香韵、甜香香韵明显提升，烤烟烟香、清香、果香有所增加；对口味风格的影响主要表现为可改善卷烟甜感；对舒适感特征的影响则主要表现为可降低口腔刺激/舌部灼烧，减少口腔残留，增加烟气收敛感，降低喉部干燥和鼻腔刺激；对烟气特征的影响主要表现为提升香气、增加香气丰富性、柔和烟气,使烟气更细腻圆润、掩盖杂气。

表4 冬虫夏草提取液制备的卷烟样品感官评价结果Table 4 The sensory evaluation results of cigarette samples prepared by Cordyceps sinensis extract 分

3 结论

本文通过对冬虫夏草提取液进行香味成分分析，共检出香味成分59种，其中主要包括丁二酮、乳酸乙酯、γ-丁内酯、丁酰乳酸丁酯、椰子醛等具有奶甜香韵的香味成分。进一步针对冬虫夏草虫草酸和虫草多糖，采用Py-GC-MS在300 ℃、600 ℃、900 ℃下进行裂解产物分析，确定了虫草酸和虫草多糖在热裂解过程中可以释放出小分子的脱水单糖和小分子的醛、酮类等物质，这些物质呈现出多种香韵风格，对于塑造卷烟特色风格、提升品质具有重要作用。将冬虫夏草提取液添加至卷烟中，通过感官评吸发现冬虫夏草提取液对卷烟香气风格的影响主要表现为可明显提升奶香香韵、甜香香韵，增补烤烟烟香、清香、果香；在口味风格方面为可提升卷烟甜感；在舒适感特征方面可降低口腔刺激/舌部灼烧，减少口腔残留，增加烟气收敛感，降低喉部干燥和鼻腔刺激；在烟气特征方面可提升香气、增加香气丰富性、柔和烟气使烟气更细腻圆润、掩盖杂气。冬虫夏草提取液中含有能呈现多种香韵的化合物，这些物质是赋予卷烟特色风格的关键物质，而具体每种香味物质对卷烟感官作用的影响过程及机理则是下一步的研究方向。