千金子制霜前后提取物对人胚肾细胞HEK293的体外毒性作用△

杨子烨，张桂梅，王佩华，王慧楠，姜明瑞，张婧秋，岳珠珠，王志成，王英姿

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

千金子系大戟科大戟属植物续随子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟种子，味辛，性温，归肝、肾、大肠经，具有泻下逐水、破血消癥之功[1]，可用于水肿、痰饮、二便不通、积滞腹胀、瘀血经阻，外治疣赘、顽癣[2-3]。千金子作为泻下逐水药中的有毒中药，常制霜减毒后使用，但毒性一直制约着千金子的临床应用。目前初步研究认为，千金子炮制减毒的机制主要与制霜后二萜醇酯类化合物含量降低有关，有研究表明千金子制霜后千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、千金子素L8的含量明显降低[4-6]。

近年来文献报道大戟科中药多具有肾毒性[7-10]，但未见对千金子肾毒性作用的研究。人胚肾细胞HEK293 是源于胚胎肾脏组织的永生化细胞，常用于中药的体外肾毒性研究[11-12]，因此本研究以HEK293 细胞为研究对象，通过比较千金子制霜前后提取物对HEK293 细胞的毒性差异，为探讨千金子制霜减毒的作用机制提供新思路，为千金子的临床安全应用提供参考。

1 材料

千金子饮片（安徽沪谯中药饮片厂，批号：1203070692）经北京中医药大学的刘春生教授鉴定为大戟属续随子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟种子。千金子生品及霜品提取物均为实验室自制。

DMEM 培养基（批号：10569044）、胎牛血清（批号：10091-418）、胰酶（批号：15050057）、青霉素-链霉素双抗（批号：15140122）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号：C10010500BT）均购于美国Thermo公司；细胞增殖检测试剂盒（批号：C35006）、细胞凋亡检测试剂盒（批号：C1062S）、细胞周期检测试剂盒（批号：C1052S）均购于上海碧云天生物技术有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（批号：A020-2）、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（批号：A006-2-1）、尿素氮（BUN）检测试剂盒（批号：C013-2-1）、肌酐（Cr）检测试剂盒（批号：C011-2-1）均购于南京建成科技有限公司；实验用水由密理博纯水仪制备。

IX51 型倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）；311 型CO2恒温培养箱、1550 型酶标仪（美国Thermo公司）；HR1500-IIA2型生物安全柜（海尔集团）；5424 型离心机（德国Eppendorf 公司）；Milli-Q Biocel 型纯水机（美国Millipore 公司）；AUW120 D220D型分析天平（日本岛津公司）；BD-C6型流式细胞仪（美国BD公司）。

HEK293 细胞来自美国模式菌种收集中心（ATCC）细胞库。

2 方法

2.1 千金子生品、霜品提取物及供试品溶液的制备

千金子霜品由本实验室采用压制法对千金子去油制霜而成，参考《中华人民共和国药典》2020 年版千金子霜项下方法[1]，取适量千金子，去皮取净仁，碾碎如泥，经微热，压榨除去大部分油脂，含油量符合要求后，取残渣研制成符合规定的松散粉末。制备的千金子霜含油量为19.2%。

分别称取千金子生品、霜品250 g 置于量瓶中，加95%乙醇加热回流提取3 次。将提取液放冷后滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，加适量水分散，以等体积石油醚为溶剂萃取3 次，回收溶剂得千金子生品、霜品石油醚提取物。

取相当于生药量0.32 g 的千金子生品、霜品提取物，加入二甲基亚砜（DMSO）50 mL，制成生药质量浓度为6.4 mg·mL–1的母液，以DMEM 培养基等比例稀释，得质量浓度分别为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0、3 200.0、6 400.0 μg·mL–1的供试品溶液，各供试品溶液以0.22µm的滤膜滤过后，备用。

2.2 细胞培养

HEK293 常规培养于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养基中，置于37 ℃、CO2体积分数5%、相对湿度70%～80%的培养箱中培养。当细胞密度达80%～90%时，用胰蛋白酶消化，按照1∶4 进行传代，取状态良好的细胞进行实验。

2.3 CCK-8法检测HEK293细胞存活率

将处于对数生长期的HEK293 细胞接种于96 孔板中，每孔5000 个细胞，培养过夜。待细胞生长到汇合状态，加入质量浓度分别为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0、3 200.0、6 400.0 μg·mL–1的各千金子供试品溶液，同时设置空白组（只加入等体积的DMEM 培养基）和对照组（只加入细胞和等体积的DMEM 培养基），每组设置5 个复孔，处理48 h 后每孔加入CCK-8 溶液10 µL。在37 ℃孵育1 h 后，利用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（A），按照公式（1）计算细胞存活率。

2.4 细胞数目及形态观察

选择对数生长的HEK293细胞，以1×105个/孔均匀接种于6 孔板，分为对照组，千金子生品低、中、高质量浓度（100、200、400 μg·mL–1）组和千金子霜品低、中、高质量浓度（100、200、400 μg·mL–1）组。细胞置于CO2恒温培养箱中培养24 h，各给药组分别加入相应质量浓度的千金子生品和霜品提取物溶液1 mL。对照组给予等体积无血清细胞培养液，每组分别设3个复孔。于CO2恒温培养箱中培养48 h 后，置于倒置相差显微镜下观察HEK293 细胞数目及细胞形态，并拍照。

2.5 碘化丙啶（PI）染色法检测细胞周期

选择对数生长的HEK293 细胞，细胞分组及处理同2.4 项下。培养48 h 后，各给药组分别加入相应质量浓度的千金子生品和霜品提取物溶液1 mL。对照组加入等体积无血清细胞培养液，每组分别设置3 个复孔。在培养箱中培养48 h 后，收集细胞，并用PBS 重复洗涤，弃去上清液后，加入预冷的70%乙醇1 mL 固定，轻轻吹打混匀，在4 ℃放置过夜。染色前用PBS 洗去固定液，1000×g离心5 min。加入PI/RNase staining buffer 0.5 mL混匀，避光条件染色30 min 后，使用流式细胞仪在激发波长488 nm红色荧光下检测。

2.6 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

选择对数生长的HEK293细胞，细胞分组及处理同2.4项下。在细胞培养箱中培养48 h后，用0.25%胰酶消化处理贴壁细胞，用预冷的PBS 溶液重复洗涤，1000×g离心5 min，弃上清。加入Binding Buffer 300 μL 于样品管中使细胞悬浮，再加入Annexin VFITC 5 μL 及PI 10 μL，避光条件孵育15 min，最后用流式细胞仪进行检测。

2.7 试剂盒检测生化指标

选择对数生长的HEK293细胞，细胞分组及处理同2.4项下。培养48 h后收集细胞上清液，按试剂盒说明书检测上清液中BUN、Cr、LDH 水平。每孔细胞用PBS 溶液重复洗涤后，加入RIPA 细胞裂解液裂解30 min，收集细胞，4 ℃、12 000 r·min–1离心10 min（离心半径为8.4 cm），取上清液，按照试剂盒的说明书测定细胞裂解液中GSH水平。

2.8 统计学处理

采用SAS 9.4 软件对实验数据进行统计分析，各组数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 千金子制霜前后对HEK293细胞存活率的影响

CCK-8 结果表明，作用于HEK293 细胞48 h 后，与对照组比较，千金子生品组质量浓度为50.0～6 400.0 μg·mL–1时，细胞存活率呈剂量依赖性降低（P<0.01）；与千金子生品相应质量浓度组比较，千金子霜品组质量浓度为50.0～1 600.0 μg·mL–1时，细胞存活率显著升高（P<0.01），且呈量-效关系，见表1。

表1 千金子生品和霜品对HEK293细胞存活率的影响（,n=5）

表1 千金子生品和霜品对HEK293细胞存活率的影响（,n=5）

注：与对照组比较，**P<0.01；与千金子生品相应质量浓度组比较，##P<0.01。

3.2 千金子制霜前后对HEK293 细胞数目及形态的影响

结果显示，对照组HEK293 细胞数目多且形态呈梭形，细胞间隙较小，生长情况良好。与对照组比较，千金子生品组细胞数目减少、形态皱缩、体积变小、细胞间隙变大、凋亡小体增加。随着千金子生品剂量增加，死亡细胞数目增加。与千金子生品组比较，千金子霜品相应质量浓度组细胞数目增加、形态皱缩的情况得以改善、细胞间隙缩小、凋亡小体减少、死亡细胞数目减少，且呈剂量依赖性，见图1。

3.3 千金子制霜前后对HEK293细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果发现，与对照组比较，千金子生品各质量浓度组HEK293 细胞G0/G1、G2/M 期比例显著降低（P<0.05，P<0.01），S期细胞比例显著升高（P<0.01）。与千金子生品组比较，千金子霜品相应质量浓度组S 期细胞比例显著降低（P<0.01），G2/M 期细胞比例升高（P<0.05，P<0.01），提示千金子生品可导致HEK293 细胞周期阻滞，而制霜后可明显降低S 期细胞比例，升高G2/M 期细胞比例，结果见表2。

表2 千金子生品和霜品对HEK293细胞周期的影响（,n=3）

表2 千金子生品和霜品对HEK293细胞周期的影响（,n=3）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与千金子生品相应质量浓度组比较，#P<0.05，##P<0.01；表3～4同。

3.4 千金子制霜前后对HEK293细胞凋亡的影响

与对照组比较，千金子生品各质量浓度组HEK293 细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率显著升高（P<0.05，P<0.01），呈剂量依赖性；与千金子生品组比较，千金子霜品相应质量浓度组可显著降低细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率（P<0.01），且呈剂量依赖性，结果见表3。

表3 千金子生品和霜品对HEK293细胞凋亡的影响（,n=3）

表3 千金子生品和霜品对HEK293细胞凋亡的影响（,n=3）

3.5 千金子制霜前后对HEK293 细胞肾功能指标的影响

与对照组比较，千金子生品各质量浓度组HEK293细胞中GSH 水平显著降低（P<0.01），LDH 活性显著升高（P<0.01），BUN、Cr 水平显著升高（P<0.05，P<0.01）。与千金子生品组比较，千金子霜品相应质量浓度能显著提高HEK293 细胞中GSH 水平（P<0.01），降低LDH活性和BUN、Cr水平（P<0.05，P<0.01），且具有一定的剂量相关性，见表4。

表4 各组HEK293细胞上清液中LDH、BUN、Cr水平及细胞内GSH水平（,n=3）

表4 各组HEK293细胞上清液中LDH、BUN、Cr水平及细胞内GSH水平（,n=3）

4 讨论

中药体外肾损伤可降低肾细胞存活率，导致细胞形态变差，BUN、Cr 溢出而进入血浆。BUN、Cr是机体的蛋白质代谢产物，反映氮的分解和肾的排泄功能，常用于肾脏疾病和药物性肾组织损伤的监测和诊断[13-14]，其含量变化与肾细胞损伤程度直接相关。LDH 是广泛分布于肾细胞内中的生化酶，正常时不能透过细胞膜，当细胞受损或缺氧时外泄到培养液中，故LDH 细胞外活力增高程度与肾损伤程度密切相关[15-17]。氧化损伤是导致肾损伤发生的机制之一，GSH 是一种细胞质中普遍存在的抗氧化物，在细胞内能清除过氧化物代谢产物，保护细胞免受氧化性伤，当GSH 水平下降，机体氧自由基的清除能力降低，可导致机体出现严重的脂质过氧化反应[18]，造成组织细胞损伤。综上，当肾细胞受到损伤时，机体内氧化指标和肾功能指标异常，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

细胞周期是细胞生命活动的动态过程，从功能角度分成G0/G1期、S期和G2/M期[19]。当细胞受到一定的刺激后，细胞周期运转过程会出现障碍，不能使细胞平稳正常进入下一个时期，造成细胞周期阻滞直接导致细胞凋亡，抑制细胞增殖。细胞凋亡是细胞程序化死亡，经一系列基因活化及调控细胞有序的、自主的主动死亡过程，在细胞内稳态、细胞衰老和机体生长发育等方面发挥着重要作用[20]。当肾细胞受到损伤时，能够引起其细胞周期明显阻滞，从而抑制细胞增殖与分化，促进细胞凋亡。

本研究从细胞增殖与凋亡、氧化损伤及肾细胞功能角度初步探讨了千金子制霜前后提取物对HEK293 细胞的毒性损伤及作用机制，实验结果表明，千金子生品对HEK293 细胞增殖有明显的抑制作用，呈一定的量-效关系，并使细胞形态变差；千金子霜品对HEK293 细胞增殖的抑制作用明显降低，可提高其存活率，并改善细胞形态。结合文献[21-25]及本实验结果分析，千金子生品造成肾细胞损伤可能有以下几种途径：1）降低HEK293 细胞在G0/G1期、G2/M 期的比例，升高S 期的比例，明显抑制S 期向G2/M 期的转化，导致细胞复制受阻，减慢细胞分裂速度，降低细胞存活率，促进细胞凋亡。2）造成肾细胞氧化损伤，机体内积聚过多氧自由基，引发过氧化脂质反应，从而降低LDH和GSH水平，导致肾细胞膜损伤及细胞代谢异常，从而促进细胞凋亡。3）使肾细胞膜受损，BUN、Cr等通过细胞膜溢出细胞进入血浆，肾功能异常，造成HEK293细胞过度凋亡。千金子制霜后可通过减轻细胞氧化损伤，改善肾细胞功能损伤，减少细胞凋亡从而降低肾毒性，这为进一步阐明千金子制霜减毒的机制提供了参考。