大鳍鳠GHR 基因CDS 区克隆及生物信息学分析

葛玲瑞，刘科均，张建国

（湖南生物机电职业技术学院，湖南 长沙 410127）

生长激素（growth hormone，GH）是动物脑垂体分泌的、具有促进机体生长和蛋白合成等作用的单链多肽。GH 与生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）结合，可以启动信号传导促进胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor，IGF-Ⅰ）的表达，而IGF-Ⅰ通过血液循环运往各个组织，开启促进动物体生长的功能[1]。GH 效应的发挥主要受组织中GHR 数量及功效的影响[2]。目前已有数10 种鱼类的GHR基因被克隆，包括金鱼（Carassius auratus）[3]、黄颡鱼[4]、河川沙塘鳢[5]、建鲤[6]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[7]、南方鲇（Silurus meridionalis）[8]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[9]、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）[10]、黄鳍鲷（Sparus latus）[11]等。

大鳍鳠（Hemibagrus macropterus）属鲇形目鲿科鳠属，其肉质细嫩、骨刺少，为优质食用鱼，具有较高的经济价值。目前对大鳍鳠的研究主要集中在繁殖生物学[12]、遗传多样性[13]及其免疫[14-15]等方面，而关于大鳍鳠生长、抗逆等方面的研究报道还相对较少，尤其是关于大鳍鳠GHR基因和GHR基因的生物信息学分析的研究尚未见报道。基于此，笔者利用cDNA 末端快速扩增（RACE）的方法成功获取了大鳍鳠GHR基因的CDS 区序列，并对大鳍鳠GHR基因CDS 区进行了生物信息学分析，为今后大鳍鳠生长调控机制和GHR基因及相关信号通路的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用大鳍鳠样品取自沅陵辉佳水产养殖合作社养殖基地，体重为（5.34±1.22）g，体长为（6.13±0.42）cm。样品经解剖后取全脑和肝脏组织，投入液氮中速冻后于-80℃冰箱中保存备用。

其他试验材料包括SMARTer®RACE 5′/3′试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司]，TRIzol Reagent、The ReverTra Aceαfirst-strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒[生工生物工程（上海）有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成从大鳍鳠转录组中获得GHR基因的部分序列，设计克隆大鳍鳠GHR基因的开放阅读框（ORF）序列，利用Prime Explorer 软件设计引物（表1）。

表1 大鳍鳠GHR 基因的克隆所用引物

1.2.2 总RNA 提取及cDNA合成取大鳍鳠全脑组织，按照TRIzol法提取总RNA，检测RNA质量和浓度。参照反转录试剂盒说明书，将RNA 反转录为cDNA，然后存放于-80℃冰箱保存。

1.2.3 PCR 扩增及克隆测序以大鳍鳠全脑的总RNA 为模板，根据反转录试剂盒的操作步骤，反转录出全脑的cDNA。通过RACE 技术，克隆出5'和3'端部分序列并送擎科生物科技有限公司进行测序，利用DNAMAN 软件对测序结果进行拼接，获得大鳍鳠GHR基因cDNA 序列。

1.2.4 生物信息学分析利用NCBI 中OFR Finder 程序对大鳍鳠GHR基因核苷酸序列进行开放阅读框分析；利用NCBI 获取不同物种GHR基因的核苷酸序列，使用DNAStar 7.0 软件中的MegAlign 模块进行相似性分析并构建系统进化树；利用ProtParam 分析大鳍鳠GHR 蛋白质的理化性质；使用SignalP 4.1 Server预测信号肽；利用TMHMM 预测跨膜结构域；使用NetPhos 3.1 Server 预测磷酸化位点；使用NetNGlyc 1.0 Server 预测N-糖基化位点；使用YinOYang 1.2 Server预测O-糖基化位点；使用Cell-Ploc 2.0 进行蛋白亚细胞定位；利用SPOMA 和Phyre2 分析蛋白质的二、三级结构；利用SMART 预测蛋白质的功能结构域和蛋白互作关系。具体网址如表2 所示。

表2 生物信息学分析软件

2 结果与分析

2.1 大鳍鳠GHR 基因核苷酸序列及氨基酸序列分析

利用NCBI 中的ORF Finder 对测序得到的大鳍鳠GHR 基因核苷酸序列进行了开放阅读框分析，发现其ORF 区长1 731 bp，共计编码576 个氨基酸（图1）。通过DNAMAN 对序列进行分析，发现其核苷酸序列A、T、C、G 含量分别为25.1%、26.7%、24.4%、23.8%。

图1 大鳍鳠GHR 基因开放阅读框序列及推导的氨基酸序列

2.2 GHR 基因相似性分析和系统进化树构建

将克隆所得大鳍鳠GHR基因CDS 区序列与其他物种进行相似性比对，结果（图2）显示，大鳍鳠GHR基因CDS 区序列与黄颡鱼、斑点叉尾鮰、鲤鱼、斑马鱼、牛、人、小鼠、鸡和林蛙的相似性分别为90.3%、88.7%、66.9%、65.7%、44.2%、46.2%、46.2%、48.2%和45.8%；其中，大鳍鳠GHR基因核苷酸序列与黄颡鱼的相似性最高，与林蛙的相似性最低。进一步构建系统进化树（图3）发现，大鳍鳠、黄颡鱼等鱼类与哺乳动物进化关系较远。

图2 大鳍鳠GHR 基因不同物种间相似性分析

图3 大鳍鳠GHR 基因系统进化树

2.3 生物信息学分析结果

2.3.1 大鳍鳠GHR 蛋白的理化特性、跨膜区和信号肽预测使用ProtParam 程序对大鳍鳠GHR 蛋白理化特性、跨膜区和信号肽进行预测分析，大鳍鳠GHR 蛋白分子式为C2900H4483N765O888S28，分子量为65 170.77，理论等电点为4.94，是一种碱性蛋白。该蛋白的不稳定指数为55.81，为不稳定蛋白；半衰期为30 h，脂肪系数为83.16，总平均亲水性为-0.368，为亲水性蛋白。信号肽预测结果显示，该蛋白区分剪切位点的C 值为0.704，区分信号肽位置区域的S 值为0.939，Y 值为0.758，大于设定阈值（0.5），表明该蛋白有信号肽结构，属于分泌蛋白，信号肽剪切氨基酸位点在第22 和23 位之间（图4）。该蛋白有1 个跨膜结构域，位于氨基酸序列的第254～273 位，属于跨膜蛋白（图5）。

图5 大鳍鳠GHR 蛋白跨膜结构域预测

2.3.2 大鳍鳠GHR 蛋白的磷酸化和糖基化位点预测预测分析结果（图6）显示，GHR 蛋白有34 个丝氨酸修饰位点和21 个苏氨酸修饰位点（图6A），可能有13 个N-糖基化修饰位点（图6B）和有91 个O-糖基化修饰位点（图6C）。

图6 大鳍鳠GHR 蛋白磷酸化和糖基化位点预测

2.3.3 大鳍鳠GHR 蛋白的结构预测二级结构预测结果显示，大鳍鳠GHR 蛋白主要是由α-螺旋（20.66%）、延伸链（24.13%）和无规则卷曲（55.21%）组成（图7）。该蛋白的三级结构与二级结构相符（图8）。

图7 大鳍鳠GHR 蛋白二级结构

图8 大鳍鳠GHR 蛋白三级结构预测

2.3.4 大鳍鳠GHR 蛋白的亚细胞定位、功能结构域和蛋白互作分析Cell-Ploc 2.0 在线工具预测结果显示，大鳍鳠GHR 蛋白主要在细胞膜上发挥作用。由图9 可知，该蛋白胞外区含有一段22 个氨基酸组成的信号肽序列（1～22 aa）、一个SCOP 结构域（SCOP：38～136 aa）和 一个FN3 结构域（FN3：140～230 aa），跨膜区包括跨膜结构域（254～273 aa），胞内区包含GHBP 结构域（GHBP：374～548 aa）。从图10 中可知，该蛋白与GH1、GH2、CISH、JAK2 和STAT5A 等存在相互作用。

图9 大鳍鳠GHR 蛋白结构功能结构域分析

图10 大鳍鳠GHR 蛋白互作分析

3 讨 论

有报道称，在一些硬骨鱼类中存在2 种GHR。该研究通过RCAE 的方法，成功克隆到大鳍鳠的GHR基因，并获得了其完整的CDS 区序列，该序列包含1 731 个碱基，编码576 个氨基酸，其蛋白氨基酸数量与其他鱼类有所差异。生物信息学分析显示，大鳍鳠GHR 蛋白包含了一个细胞外配体结合域（253 aa）、一个跨膜结构域（19 aa）和一个胞内信号转导结构域（174 aa）。大鳍鳠GHR 蛋白属于跨膜蛋白，其主要定位在细胞膜上，可作为一种分泌蛋白调控多种基因表达[16]。分析发现，大鳍鳠GHR 蛋白也存在信号肽结构，其切割位点位于第22 和23 个氨基酸之间。而信号肽可以把蛋白质引导到不同膜结构的亚细胞器内[17]，从而发挥相应功能。从相似性和进化分析来看，大鳍鳠与黄颡鱼和斑点叉尾鮰的亲缘关系较近，同源性达到了80%以上，由此说明鱼类的GHR基因保守性较好，但是与哺乳动物之间存在较大差异。从大鳍鳠GHR 蛋白的二、三级结构结果来看，GHR 蛋白存在着大量的无规卷曲，占比达到了55.21%，使得其三级结构呈现出复杂的立体结构。

大鳍鳠GHR 蛋白互作分析表明，该蛋白与GH1、GH2、JAK2 和SATA5 等存在紧密的联系和相互作用。在动物体的生长发育过程中，GH、GHR 所在的GH/IGF 轴发挥着重要的作用。研究表明，GHR 与GH 相结合后，能诱发JAK2 等细胞因子酪氨酸磷酸化，以4条不同的信号通路传入细胞内引起一系列的生理效应[18]。在络氨酸激酶JAK2-STAT 信号转导途径，GH 与GHR 结合会激活酪氨酸激酶，GHR 信号转导就起始于此[19]。GH 还能使信号转导及转录活化蛋白（STAT1，STAT3 及STAT5 等）磷酸化，从而调控相关基因的转录，进而调节细胞的多种代谢活动[20]。JAK2 信号通路主要涉及信号转导、信号转录因子和活化子（STATS），从而引起下游信号的传导。