二陈汤对Lewis肺癌移植瘤血管生成及PI3K/Akt表达的影响

屈直，王芬，李志明，张燕娜，王玥慧

（北京中医药大学，北京 100029）

根据2020年全球癌症统计报告，肺癌是世界病死率最高及发病率第二的癌症［1］，也是21世纪以来迅速发展的疾病之一。我国是全球范围内肺癌疾病负担最重的国家［2］，在老龄化、环境污染、吸烟等多重因素的影响之下，新罹患肺癌和以肺癌为主要死亡原因的患者人数逐年递增。目前临床上多数患者发现时即是中晚期，其五年生存率尚不到20%［3］。铂类药物化疗是治疗肺癌的主要手段，然而其耐药性、副作用、效益率低等问题成为制约其临床疗效的瓶颈［4］。现代研究表明，中医药在调节免疫功能、促进凋亡、抑制血管生成等方面对肺癌的治疗有较好的作用［5］。二陈汤是临床经典方药，具有燥湿化痰、理气和中的功效。前期研究显示，二陈汤加减方联合含铂化疗方案可降低痰证非小细胞肺癌患者外周血中IL－17 的表达［6］。在动物实验中，二陈汤加减方的抑瘤率为34.71%，且可改善小鼠体内CD4+T 淋巴细胞水平［7］。本次研究通过以二陈汤干预Lewis 肺癌小鼠，观察其对移植瘤的作用，并进一步研究其对VEGF/VEGFR－2 分子轴以及对PI3K/Akt通路的影响，探讨其抗肺癌的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及瘤株

40 只4～6 周龄C57BL/6 雄性小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014－0004。在中国医学科学院基础研究所SPF 级动物房进行饲养以及给药，环境温度23～26 ℃，相对温度50%～60%，环境噪音＜60 dB。用于造模的Lewis 瘤株由中国医学科学院基础研究所提供。

1.2 实验药物

二陈汤（组方：法半夏15 g，陈皮15 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，生姜7 g和乌梅8 g）中所包含中药均由北京中医药大学东方医院中药房提供，常规水煎煮，根据小鼠与人的剂量换算公式［6］计算出小鼠每日剂量，将药液浓缩至1.35 g/mL，冷冻保存。10 mg/瓶注射用顺铂，由北京中医药大学东方医院西药房提供，批号：AA1A7030B。

1.3 实验试剂

VEGFR－2、VEGF 抗体（Abcam 公司，货号：ab68153、ab39256）；PI3K、Akt 抗体（CST 公司，货号：6342S、4968S）；β－肌动蛋白抗体（Proteintech group，货号：Ag27042）；CD34 抗体（Proteintech group，货号：14486－1－AP）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，货号：PC0020）。

1.4 实验仪器

超净工作台（VD－650）；倒置显微镜（日本，Olympus公司）；5810 R离心机（德国，Eppendorf 公司）；酶标仪（美国，Pro－mega 公司）；DYCZ－24DH 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；92－14860－00 型凝胶成像系统（美国，Alpha Innotech公司）。

1.5 Lewis肺癌小鼠造模及分组给药

40只小鼠随机分为对照组、中药组、联合组和顺铂组，每组各10 只。将细胞密度为6×106个/mL 的小鼠Lewis 肺癌细胞在C57BL/6 小鼠右腋下以0.2 mL/只的剂量进行皮下注射接种。7 d后，可在小鼠腋窝皮下观察到绿圆形隆起，则标志着造模成功。造模成功后，对照组予以0.4 mL 生理盐水日1 次灌胃；中药组予以0.4 mL 二陈汤药液日1 次灌胃；顺铂组予以0.4 mL 生理盐水灌胃的同时，用注射用顺铂以200 μL/20 g 剂量进行腹腔内灌注，每隔3 d灌注1次；联合组同时给予中药灌胃和顺铂腹腔内灌注。各组小鼠均连续干预15 d。

1.6 观察指标

1.6.1 一般生存状态观察

每日观察各组小鼠的外在一般行为状态、进食量、排便、气味和毛色的状况，每周称量1 次体质量，并对各组小鼠的状态进行评估。

1.6.2 Lewis肺癌小鼠抑瘤率测定

第21 天给药结束24 h 后，用脱椎法处死小鼠，剥离肿瘤组织称重并计算抑瘤率，肿瘤组织分成两部分，一部分置于甲醛中固定，另一部分于－20 ℃冷冻保存。

抑瘤率=（模型组平均瘤质量－治疗组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量× 100%

1.6.3 免疫组化法检测各组Lewis 小鼠瘤组织中VEGF、VEGFR－2、PI3K、Akt的含量及MVD值

用病理切片机将石蜡包埋后的肿瘤组织制成切片，脱蜡水化后用3%过氧化氢洗涤，将切片置于抗原修复液中进行修复（置于微波炉中，高火加热15 min），取出待其冷却，滴加一抗（稀释浓度为1∶100），放入湿盒中过夜，第2天将组织37 ℃恒温孵育30 min，冲洗后加入二抗，等待30 min 后进行显色，苏木精复染，脱水封片，封好后在显微镜下观察蛋白的表达及分布，通常蛋白表达可见细胞核中及胞质中有棕黄色颗粒样物质，用Image-Pro Plus 6.0 软件分析图像，蛋白的表达水平以IOD值表示。

CD34 染色后，选择2 个血管化程度较高的区域进行微血管计数，采用低光度数（× 10 物镜）进行计数。最终的MVD 值为每个高血管化区域（总面积：2.65 mm2）3个高倍视野（×25物镜）的平均值。具有清晰管腔或明确线形血管形状的血管用于计数。

1.6.4 Western blot 法检测各组Lewis 小鼠瘤组织中PI3K、Akt、VEGF、VEGFR－2蛋白含量

将肿瘤组织剪碎在冰上进行慢速研磨，研磨后所获得的溶液进行细胞裂解并抽提蛋白，用BCA 检测试剂盒测定所获得的蛋白浓度。蛋白变性后，冷却上样，凝胶电泳半干法转入PVDF 膜后置于封闭缓冲液（摇床振荡1 h），分别加入目的蛋白一抗，4 ℃过夜，TBST洗涤后孵育二抗，用ECL 显影条带显影并输入电脑进行灰度分析。

1.7 统计学方法

本实验采用SPSS 21.0 软件对数据资料进行处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，统计学方法采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；不满足正态分布则使用非参数检验进行分析；计数资料采用卡方检验。以P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般生存状态比较

通过观察，各组小鼠在接种肺癌细胞1 周后均逐渐出现不同程度的皮毛光泽消失、脱落，反应迟缓，饮食量减少等现象，其中对照组小鼠尤为明显。对照组及中药组在造模后7 d 出现死亡状况（对照组2 只，中药组3 只，顺铂组1 只）。而联合组小鼠一般状况与其他组比较则相对较好，饮食量可，反应较灵敏，体质量无明显下降，生存质量相对较好。

2.2 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较

中药组、联合组及顺铂组抑瘤率分别为13.04%、22.94%和21.26%。经检验，与对照组相比，中药组、联合组及顺铂组Lewis小鼠瘤重均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；顺铂组与中药组瘤重比较差异具有统计学意义（P＜0.05），其余各组比较无统计学意义。见表1。

表1 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较（±s）

表1 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较（±s）

注：与中药组比较，*P ＜0.05；与对照组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组别对照组中药组联合组顺铂组n8 7 9 10瘤重（g）2.75±0.24 2.45±0.44#2.02±0.57##2.20±0.42*##抑瘤率（%）—13.04 22.94 21.26

2.3 各组小鼠肿瘤组织中CD34 表达值及微血管密度（MVD）比较

联合组瘤体组织中CD34的表达值及MVD 相较于其他组均明显降低，且在一定的浓度范围内随浓度增高而降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。顺铂组CD34 的表达值及MVD 也有所下降，与其他组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肿瘤组织中CD34表达值及MVD比较（±s）

表2 各组小鼠肿瘤组织中CD34表达值及MVD比较（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与中药组比较，#P ＜0.05。

组别对照组中药组联合组顺铂组n8 7 9 10 CD34 41.07±7.22 35.15±10.74 18.15±5.45*#36.12±7.65 MVD（mm2）47.80±6.73 43.64±18.06 28.68±6.05*#32.22±8.33

2.4 各组小鼠肿瘤组织中VEGF、VEGFR－2 表达情况比较

与对照组、中药组相比，联合组、顺铂组肿瘤组织中VEGFR－2 蛋白表达明显减少（P＜0.05）。而各组之间VEGF 蛋白的表达量经比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示二陈汤作用于VEGF/VEGFR－2 分子轴的机制主要是通过抑制VEGFR 的表达。与顺铂组比较，联合组虽然VEGFR－2 的蛋白表达量更低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图1、图2、表3。

表3 各组小鼠肿瘤组织中VEGF、VEGFR－2表达比较（±s）

表3 各组小鼠肿瘤组织中VEGF、VEGFR－2表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与中药组比较，#P ＜0.05。

组别对照组中药组联合组顺铂组n8 7 9 10 VEGFR－2 0.41±0.15 0.36±0.14 0.12±0.09*#0.25±0.07*#VEGF 0.58±0.12 0.42±0.12 0.45±0.17 0.33±0.15

图1 各组小鼠瘤组织中VEGF、VEGFR－2蛋白表达情况

图2 免疫组化检测各组小鼠肿瘤组织中VEGF、VEGFR－2表达情况（×400）

2.5 各组小鼠肿瘤组织中PI3K、Akt 蛋白表达情况比较

与对照组、中药组相对比，联合组、顺铂组小鼠肿瘤组织中PI3K、Akt 蛋白的表达量减少（P＜0.05）；联合组与顺铂组比较，虽有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。而中药组与对照组经比较，蛋白的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图3、图4。

图3 免疫组化检测各组小鼠肿瘤组织中PI3K和Akt的表达情况（×400）

图4 各组小鼠肿瘤组织PI3K、Akt蛋白表达情况

表4 各组小鼠肿瘤组织中PI3K、Akt蛋白表达量比较（±s）

表4 各组小鼠肿瘤组织中PI3K、Akt蛋白表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与中药组比较，#P ＜0.05。

组别对照组中药组联合组顺铂组n8 7 9 10 PI3K 0.54±0.12 0.43±0.16 0.17±0.12*#0.12±0.09*#Akt 0.77±0.14 0.58±0.17 0.24±0.11*#0.18±0.07*#

3 讨论

二陈汤出自宋代《太平惠民和剂局方》，目前在各类呼吸系统疾病的治疗中广泛应用［8］。痰证为肺癌常见中医证候［9］，二陈汤在临床上应用于辨证为肺脾气虚兼见痰湿，症见乏力纳呆、便溏少气懒言、痰多色白、恶心呕吐等的肺癌患者。《医宗必读》云：“脾为生痰之源，肺为储痰之器”，脾胃主运化水湿，肺主通调水道，若脾胃运化无力，肺气不利，则津液营养物质集聚于肺而成痰，故治疗痰饮宜在温化、淡渗、燥湿的同时调理肺脾。方中君药半夏辛温，能燥湿化痰、和胃降逆止呕；陈皮理气燥湿化痰；茯苓健脾淡渗利湿；生姜降逆化痰止呕；乌梅收敛肺气；甘草健脾和中、调和诸药。其组方配伍标本兼顾，为燥湿化痰、理气和胃的基础方剂。二陈汤在历代医家临床治疗中更是根据患者的辨证情况化裁演变出了导痰汤、温中化痰丸等临床常用成方。

研究显示VEGF/VEGFR 轴是肿瘤调节血管生成的关键分子轴［10］。而肿瘤细胞在过度增殖过程中，微环境氧缺乏是诱导肿瘤血管生成的主要因素，环境中高水平的缺氧诱导因子1α（HIF－1α）则促进了肺癌细胞表达因子VEGF 增多［11］。VEGF 家族包括VEGFA、VEGF－B、VEGF－C、VEGF－D 等。VEGF 因子通过与其位于血管内皮细胞膜上的受体VEGFR 结合后，便会释放各种生长因子及细胞因子，促进肿瘤组织中的血管生成。VEGFR 分子根据其结构通常又有三种：VEGFR－1/Flt－1、VEGFR－2/Flk－1/KDR 和VEGFR－3/Flt－4，在肿瘤组织内发挥促血管内皮细胞增殖作用的主要是VEGFR－2［12］。研究表明，磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）信号通路在多种癌细胞中被广泛激活。该信号通路起始于PI3K 的活化，导致磷脂酰肌醇－3，4，5的产生，从而激活蛋白激酶B 和下游的mTOR 通路［13］。VEGFR－2 可通过HIF－1α 激活PI3K/Akt/mTOR 通路，从而发挥调控血管新生与重塑的作用。相应的PI3K/Akt/mTOR 通路激活后又可以通过HIF－1α 依赖性或非依赖性机制反过来提高VEGF 的分泌，从而形成一个正反馈环［14］。故通过阻断PI3K/Akt 通路，可以起到影响肿瘤血管生成的作用。

本研究结果显示，与化疗药物顺铂联用，二陈汤具有一定的抑瘤作用，且联合组在提高小鼠的生活质量及免疫功能方面作用较单用顺铂组更加突出。二陈汤联合顺铂可减少Lewis 小鼠肿瘤组织中VEGF 及其受体VEGFR－2 的表达，从而对肿瘤血管生成起到抑制作用。不仅如此，在抑制VEGF/VEGFR－2分子轴的同时，二陈汤联合顺铂还可以降低小鼠瘤体组织内PI3K、Akt 蛋白含量，从而达到多靶点、多方位调控肿瘤增殖和血管生成的作用。PI3K下游的mTOR酪氨酸激酶激活Akt，使其活化为p－Akt，形成二聚体，从细胞质转移入细胞核中，活化后的PI3K 能在细胞核中长期稳定存在，从而使其下游靶基因表达紊乱，最终导致细胞的异常增殖［15］。多个研究证实，在不同的癌种中，PI3K/Akt通路的活化与肿瘤的血管生成密切相关［16-18］，对于PI3K/Akt 通路及其与VEGF/VEGFR－2 分子轴交互作用在肿瘤中的机制研究仍有待进一步深入。

综上，二陈汤能提高Lewis 肺癌小鼠整体的生存质量，联合顺铂治疗，可对小鼠移植瘤的增殖、血管生成有一定抑制作用，其机制为通过下调PI3K/Akt 通路继而影响肿瘤组织中VEGF、VEGFR－2 分子的表达，从而起到抑制肿瘤血管生成的作用。二陈汤的作用是多靶点、整体性的调节，抗肿瘤血管生成是其抗肿瘤作用的重要机制之一。