不同浓度二甲双胍对丙泊酚所致斑马鱼神经毒性的改善作用

杨广慧 沈佳红 於阳 黄娅琴 徐佳雯 程远 孙建良

丙泊酚是目前临床上最常用的静脉麻醉药之一，具有起效迅速、代谢快、苏醒平稳等特点，尤其适用于婴幼儿手术麻醉。然而，和其他麻醉药物具有神经毒性类似，胎儿及婴幼儿早期接触丙泊酚可引起神经系统功能障碍，出现学习能力及认知功能的下降[1]。二甲双胍是双胍类降糖药，通过抑制肝糖原输出、增加胰岛素敏感性、抑制糖异生等途径降低血糖，且几乎无乳酸酸中毒及低血糖等不良反应。近年来发现二甲双胍不仅有突出的降低血糖功能，同时对神经系统有保护作用[2-5]。斑马鱼是一种新型动物模型，其基因与人类基因序列同源度高，近年来广泛应用于神经科学研究，具有体外受精、胚胎透明而易于观察及操作等特点，已成为筛查药物的首选动物模型之一[6]。笔者通过建立丙泊酚所致斑马鱼胚胎神经毒性模型，探讨二甲双胍对该模型的作用，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 野生型AB品系斑马鱼雌雄配比2∶1，自然成对交配收集受精后6 h（6 hpf）胚胎，胚胎放入养鱼用水中培养，显微镜（日本 OLYMPUS公司，型号：SZX7）下确认发育处于相同阶段后入组实验，共300个。盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字：H20023370，规格：0.5 g/片）；丙泊酚注射液（爱尔兰Aspen Pharma Trading公司，注册证号：H20171275，规格：10 mg/ml）；吖啶橙染料（美国 Sigma公司，批号：494-38-2）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（日本Nikon公司，型号：AZ100）；行为学分析仪（法国ViewPoint Life Sciences公司，型号：V3.11）。斑马鱼胚胎均培养于28℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550 μS/cm，pH 为 6.5～8.5，硬度为 50～100 mg/L CaCO3）。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理 将150个斑马鱼胚胎按随机抽样法分别置于6孔板中，30个/孔，每孔为一组，共5组。将二甲双胍1.5、3、6 mg分别加入3 ml养鱼用水中，浓度分别设置成二甲双胍500 μg/ml（M1组）、1 000 μg/ml（M2组）和2 000 μg/ml（M3组），另外两组分别为无二甲双胍的丙泊酚对照组（P组）及正常对照组（C组）。其中P组、M1组、M2组及M3组均加入丙泊酚5 μg/ml[7]，C组不作任何处理，正常培养于养鱼用水中。所有实验组每孔容量均为3 ml。

1.2.2 中枢神经细胞凋亡检测 经28℃培养1 d后，将斑马鱼胚胎剥除卵膜，并用超纯水清洗2次，于含有浓度为2.5 μg/ml吖啶橙的培养液中避光培养30 min，超纯水清洗3遍，染色后每组采用随机抽样法抽取10个置于荧光显微镜下拍照，使用NIS-Elements D 3.20软件采集并分析斑马鱼胚胎中枢神经细胞凋亡数。

1.2.3 反应能力评估 其余150个斑马鱼胚胎分组及处理同1.2.1。28℃培养5 d后，每组采用随机抽样法抽取10条斑马鱼进行反应能力评估。行为学分析仪采集20 min内2个明暗周期（即黑暗5 min、光照5 min交替2个周期）的运动速度，分析每分钟平均运动速度[8]。

1.3 统计学处理 采用SPSS 26.0统计软件。计量资料用表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnet检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组斑马鱼胚胎中枢神经细胞凋亡数的比较 C组中枢神经凋亡细胞数为（12.90±1.21）个，P组为（23.10±2.12）个，差异有统计学意义（P＜0.01），表明丙泊酚5 μg/ml可致斑马鱼胚胎中枢神经细胞凋亡。M1组、M2组及M3组中枢神经凋亡细胞数分别为（20.30±1.96）、（18.10±2.01）和（11.40±1.79）个。与 P组比较，M3组中枢神经细胞凋亡数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），说明经 2 000 μg/ml二甲双胍处理，中枢神经细胞凋亡情况得到改善，见图1、2（插页）。

图1 斑马鱼胚胎中枢神经细胞凋亡分析部位示意图（黄色虚线内为分析部位，绿色小点为凋亡细胞）

图2 5组斑马鱼胚胎中枢神经细胞凋亡表型图（绿色小点为凋亡细胞）

2.2 各组斑马鱼反应能力的比较 C组每分钟平均运动速度为（2.06±0.08）mm/s，P 组为（0.91±0.08）mm/s，差异有统计学意义（P＜0.01），表明丙泊酚 5 μg/ml可致斑马鱼每分钟平均运动速度明显减慢，反应能力降低。M1组、M2组及M3组每分钟平均运动速度分别为（0.85±0.07）、（1.15±0.06）和（1.46±0.08）mm/s，与P组比较，M2组和M3组每分钟平均运动速度增快，差异均有统计学意义（均P＜0.05），说明经1 000和2 000 μg/ml二甲双胍处理后，斑马鱼反应能力得到改善。

3 讨论

神经细胞凋亡是大脑发育的一个重要环节，在大脑发育建立中，神经细胞初始数量远超生理需要，其中50%～70%会走向凋亡，故细胞凋亡是神经发育的重要组成部分，一旦凋亡程序被外界因素干扰，就会使发育畸形的概率增加。有研究发现丙泊酚可引起神经细胞凋亡，导致认知功能障碍[9-10]。二甲双胍作为广泛使用的降糖药，近年来发现对神经系统损伤具有保护作用[2-5]。在颅内肿瘤放疗后患儿中，使用二甲双胍可以明显改善其认知功能[2]。动物实验也证实二甲双胍对中风后的小鼠具有神经修复功能[3]，二甲双胍处理的小鼠形成新的记忆比对照组小鼠快[4]。

在分子生物学水平上，二甲双胍对神经系统的保护作用机制尚不完全清楚。腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]，是目前二甲双胍在体内最主要的作用靶点之一。CREB结合蛋白（CREB-binding protein,CBP）在胚胎神经前体细胞的发育过程中必须存在，CBP需要被非典型蛋白激酶C（atypical PKC,aPKC）激活才能完成此作用。aPKC-CBP是AMPK的下游通路之一，二甲双胍作为AMPK的激动剂可以激活神经前体细胞中aPKC-CBP通路[11]，进而促进神经细胞生长及修复[4-5，12]。

在沉默信息调节因子1（silent information regulator 1,SIRT1）及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子 1α（peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α,PGC-1α）相关通路领域，已有的研究表明AMPK-SIRT1信号通路的功能紊乱可诱导七氟烷所致的神经细胞凋亡和认知功能障碍[13]。而AMPK的激动剂可以激活AMPK-SIRT1-PGC-1α通路，该通路通过抑制氧化应激和提高线粒体功能，从而减少七氟烷麻醉所致神经细胞的凋亡、发挥抗氧化作用及改善认知功能[14]。AMPK可以增加还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的水平，继而诱导激活SIRT1，而SIRT1的乙酰化可以进一步激活促进PGC-1α的表达。PGC-1α通过结合过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferatoractivated receptor,PPARγ），调节线粒体生物合成的关键蛋白并促进线粒体的功能和代谢。线粒体是自由基产生和诱发凋亡的重要场所，七氟烷麻醉可以引起术后认知功能障碍模型中大鼠海马区发生氧化应激，使氧自由基产生积累，积累的自由基可以通过过氧化线粒体膜的脂质，进而激活线粒体凋亡，最终引起神经细胞的凋亡。而七氟烷引起的氧化应激可以使用AMPK的激动剂逆转，具体表现为激活AMPK-SIRT1-PGC-1α可以逆转由于七氟烷麻醉导致的大鼠海马凋亡神经细胞数目的减少、cleaved天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-3）上调，线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）和 ATP 的下调[14]。

已有研究证明，丙泊酚所致神经细胞凋亡与中枢炎症及氧化应激有关，表现为丙泊酚可致大鼠活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）、氧化应激产物2,4-二硝基酚（2,4-dinitrophenol,DNP）和4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,HNE）及凋亡执行蛋白caspase-3等表达升高[9]。笔者推测丙泊酚亦可能通过干扰AMPK通路加重认知功能障碍，而二甲双胍作为经典AMPK激活剂，推测可以通过激活AMPK而产生丙泊酚麻醉后神经保护作用。故后续的研究仍需进一步验证二甲双胍对丙泊酚诱导神经毒性改善的具体分子机制。

本研究发现，二甲双胍1 000 μg/ml可以改善丙泊酚所致斑马鱼反应能力减低（P＜0.05），但对于中枢神经细胞凋亡数的改善尚不明显（P＞0.05）。二甲双胍2 000 μg/ml可以同时改善丙泊酚所致斑马鱼中枢神经细胞凋亡（P＜0.01）及反应能力降低（P＜0.01），故笔者推测二甲双胍对丙泊酚所致的神经毒性的保护作用存在浓度依赖。

综上所述，二甲双胍可以改善丙泊酚所致斑马鱼神经毒性，具体机制有待于进一步研究。