C60-IONP-GE11纳米粒对乳腺癌细胞的体外成像及光动力学研究

符舒琦，涂蓉，刘梦婵，洪雅敏，李韩建，尤晓光

癌症已成为当前世界威胁人类健康和生命的严重疾病之一[1]。如何早期诊断并治疗肿瘤是分子影像学研究热点之一。磁性氧化铁纳米粒子(iron oxide nanoparticles，IONP)是一种多功能磁性纳米材料，当其粒径在5～100 nm时具有超顺磁性，可作为磁共振成像(MRI)、生物催化活性(纳米酶)以及药物递送等多功能的诊疗工具，IONP合成相对简单、生物相容性好，可以对其进行进一步的表面修饰，增加水溶性并偶连靶向分子，因此可用于肿瘤磁共振显像及治疗[2-3]。C60(fullerene，富勒烯)有着独特的物理化学性质，是近年来被广泛用作肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)的光敏剂[4-5]。GE11(氨基酸序列YHWYGYTPQNVI)是首个对表面生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)具有高亲和力的人工合成小分子多肽[6]。EGFR受体高表达于上皮源性肿瘤细胞，与人类多种癌症的发生发展密切相关[7]。PDT是指通过特定波长的激光照射靶组织使其产生单线态氧、羟基自由基、过氧化氢等活性氧(reactive oxygen species，ROS)物质[8]。本研究化学合成C60-IONP-GE11靶向多功能MRI对比剂(图1)，观察其体外对乳腺癌细胞EGFR靶点靶向成像及PDT治疗作用，为后续体内实验奠定前期实验基础。

材料与方法

1.材料和设备

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231来源于国家实验细胞资源共享平台；靶向小肽GE11(QKYHWYGYTPQNVIQK)和随机小肽(random peptide，RP)(TQRKGKTHRKPHKTKT)由上海吉尔多肽有限公司合成。相关试剂和试剂盒：FBS、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、0.25%胰酶、Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)、增强型CCK-8试剂盒、ROS检测试剂盒(Beyotime Biotechnology)；DMEM高糖培养基、青霉素-链霉素-两性霉素B混合液(索莱宝)；Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(杭州联科生物)。设备采用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000，日本)，3.0T MRI和膝关节线圈(Siemens，德国)，多功能酶标仪(SynergyHTX，美国)，532 nm激光器(Oxlasers，上海)。

2.方法

①验证EGFR高表达肿瘤细胞株：免疫荧光染色：取人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)接种于共聚焦培养皿中(1×105个/培养皿)，37℃，5% CO2孵育24 h。4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗；加入500 μL染色封闭液封闭30 min；吸掉封闭液后培养皿内滴加足量1:200稀释的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜后加入比例为1：500稀释的荧光二抗，室温孵育1 h后用PBS浸洗，加200 μL DAPI荧光染料孵育5 min进行核复染，最后吸水纸吸干皿内液体在激光共聚焦显微镜下观察采集图像。

②体外MRI成像实验及普鲁氏蓝染色实验:体外MRI扫描：取MDA-MB-231细胞接种于6孔板(1×106个/孔)，将其随机分为两组：C60-IONP-GE11(实验组)和C60-IONP-RP(非靶向随机小肽对照组)，分别配备200 μL浓度为25、50、100、200、400 μg/mL的溶液与MDA-MB-231共孵育2 h，弃去培养液，PBS漂洗三次，细胞铲收集孔内细胞，加入2 mL PBS 吹打重悬后加入等体积的1%琼脂糖溶液进行MR 扫描并测量T2值。采用3.0T MR扫描仪，并选用膝关节线圈，T2加权自旋回波成像序列，参数：TR 1000 ms，TE 140 ms，视野(FOV)22 cm×22 cm，层厚0.6 mm，矩阵384×384。

普鲁士蓝染色法(铁染色)：取MDA-MB-231细胞接种于爬片中，随机将其分为两组：C60-IONP-GE11靶向对比剂(实验组)和C60-IONP-RP非靶向对比剂(对照组)，加入1.5 mL浓度为200 μg/mL的C60-IONP-GE11或C60-IONP-RP对比剂溶液，置于37℃，5% CO2培养环境下孵育12 h。加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS润洗3次。普鲁氏蓝染色试剂盒，1:1体积比例混合盐酸与亚铁氰化钾溶液细胞染色30 min后，PBS充分洗涤3次，再加伊红染色液淡染细胞核15 min，PBS润洗5 s后脱水透明、树胶封固。

表1 C60-IONP-GE11实验组和C60-IONP-RP对照组处理后的MDA-MB-231细胞的T2值

③细胞毒性实验:将人乳腺癌细胞MDA-MB-231以5×103个/孔(100 μL/孔)接种到96孔板中，待细胞充分贴壁分别加入100 μL不同浓度梯度的C60-IONP-GE11，并按照浓度梯度分为以下7组：0 μg/mL(完全培养基空白对照组)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL，每个浓度梯度设置无细胞的C60-IONP-GE11对比剂对照孔作为背景值，每个浓度设置5个复孔，置于37℃，5% CO2培养环境下孵育24 h；每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱内孵育1 h，酶标仪检测细胞在450 nm处的吸光度(optical density，OD)，按照计算公式：细胞存活率(%)=(实验孔OD值-实验组背景孔OD值)/(对照孔OD值-对照组背景孔OD值)计算细胞存活率。

④体外光动力实验：CCK8(Cell Counting Kit-8，细胞计数试剂)检测：将人乳腺癌细胞MDA-MB-231以5×103个/孔(100 μL/孔)接种到96孔板中，每孔需间隔1个空白孔以便进行光照，置于37℃，5% CO2培养环境下孵育使其充分贴壁。实验设置4个分组：①空白激光组(完全培养基)；②C60-IONP-GE11无激光组；③C60-IONP-RP+激光组；④C60-IONP-GE11+激光组。②③④组加入10 μL浓度为200 μg/mL的C60-IONP-GE11或C60-IONP-RP对比剂溶液，每组设置5个重复孔，37℃，5% CO2环境孵育24 h。光照：吸出培养基，PBS轻柔润洗2次洗去未结合对比剂，①③④组暴露于532 nm，100 mW/cm2激光下照射20 min，再孵育12 h；随后每孔加入10 μLCCK8，置于37℃，5% CO2培养箱孵育1.5 h，用酶标仪检测450 nm处的吸光度，按公式计算细胞存活率，绘制曲线。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测：将人乳腺癌细胞MDA-MB-231以每皿1×104个接种于共聚焦培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱孵育24 h，实验设置6个分组：①空白激光组(完全培养基)；②C60-IONP-GE11无激光组；③C60-IONP-RP+激光组；④200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组；⑤400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组；⑥800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组。按照分组加入对应溶液，每组加入50 μL比例为1:1000稀释后的DCFH-DA探针，置于37℃，5% CO2培养箱孵育30 min，PBS洗涤3次以洗去未结合探针；①③④⑤⑥组暴露于532 nm，100 mW/cm2激光照射20 min，共聚焦显微镜下观察活性氧产生情况，并使用Image J软件对荧光结果进行半定量分析。

3.统计分析

采用SPSS 22进行统计学分析，体外细胞光动力学实验使用Dunnett-t检验比较各组间差异，体外毒性实验和Image J半定量分析荧光强度，使用Tamhane’s T2检验比较各组间差异。

结 果

1.C60-IONP-GE11表征

透射电镜(transmission electron microscope，TEM)可见C60-IONP-GE11形态呈类球形，大小基本一致(图1a)，动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测得IONP的水化直径为(29.4±2.1)nm，C60-IONP-GE11的水化直径为(37.7±3.2)nm(图1b、d)，Zeta电位显示IONP电位为(38.8±0.4)mV，C60-IONP-GE11电位为(-35.9±0.7)mV(图1c、d)；傅氏转换红外线光谱分析(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)显示，羧基富勒烯在3000 cm-1左右形成大而宽的峰，且以3000 cm-1为中心对称，是缔合羧基的吸收，1433 cm-1、1191 cm-1、525 cm-1是C60的特征峰，578 cm-1是Fe-O特征振动峰，多巴胺修饰的Fe3O4在3400 cm-1、1597 cm-1、1265 cm-1出现氨基的吸收峰，C60-IONP-GE11在3419 cm-1的吸收峰是v(-NH2)和v(-OH)的叠加，在1733 cm-1、1672 cm-1、0～1200 cm-1等出现多个酰胺键中强特征峰(图2a)，综上可以看出C60和GE11被偶联在磁性颗粒的表面；磁滞曲线显示C60-IONP-GE11与IONP有相似的磁饱和强度(图2b)。

2.EGFR高表达肿瘤细胞株的筛选

免疫荧光结果显示，DAPI染液将细胞核染成蓝色，MDA-MB-231细胞膜上有大量Cy3荧光(图3)。

图1 C60-IONP-GE11的A)TEM;B)DLS;C)Zeta电位;D)Zeta电位统计表。 图2 a)C60-IONP-GE11合成FTIR图；b)IONP和C60-IONP-GE11磁化曲线。

3.体外MRI成像实验及普鲁氏蓝染色实

为了评价多功能对比剂C60-IONP-GE11的靶向性和成像能力，对EGFR高表达的MDA-MB-231细胞进行体外MR成像。C60-IONP-GE11浓度为100 μg/mL时，T2WI开始出现负性强化，随着浓度增加，T2WI信号降低，非靶向随机小肽C60-IONP-RP对照组未见明显负性强化(图4)。表1示，分析实验组与对照组浓度与T2值的相关性，结果显示实验组和对照组的浓度与T2值均呈负相关(R值为-0.928、-0.540，表1)，其中实验组的相关性较对照组更强，并可得实验组线性回归方程为Y=145.898-30.269×X，R2=0.862。

表2 各组与实验组对比统计表

普鲁士蓝染色结果显示，C60-IONP-GE11实验组可见细胞明显蓝染，非靶向随机小肽C60-IONP-RP对照组未见明显染色(图5)。

图3 MDA-MB-231细胞EGFR表达免疫荧光图(激光共聚焦扫描显微镜下×1000，标尺为5 μm)。a)DAPI染核；b)Cy3染膜；c)明场细胞轮廓；d)核膜融合图。 图4 a)C60-IONP-GE11处理后的MDA-MB-231细胞的T2WI图；b)C60-IONP-RP处理后的MDA-MB-231细胞的T2WI图。 图5 MDA-MB-231细胞的普鲁士蓝染色图(荧光倒置显微镜，×1000，标尺为20μm)。a)C60-IONP-GE11处理后；b)C60-IONP-RP处理后。

4.细胞毒性实验

为了评估对比剂C60-IONP-GE11的细胞毒性，笔者测定了不同浓度C60-IONP-GE11处理后MDA-MB-231细胞的细胞存活率。与空白组相比，C60-IONP-GE11浓度为25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL时，存活率分别为(98.86±3.65)%、(96.08±4.09)%、(92.76 ±3.03)%、(90.71±3.21)%、(88.19%±1.79)%、(84.44%±2.64)%，差异有统计学意义(F=18.988，P<0.001，图6)。

5.体外光动力实验

为了研究C60-IONP-GE11对MDA-MB-231细胞的光动力学治疗效果，测定了不同处理条件下的细胞存活率。单纯激光组细胞存活率为(92.45±4.99)%，C60-IONP-GE11无激光组细胞存活率为(95.86±4.05)%、非靶向随机小肽C60-IONP-RP对照组激光处理后细胞存活率为(83.39±3.95)%，而C60-IONP-GE11实验组激光处理后的细胞存活率仅为(22.79±4.84)%，差异有统计学意义(P<0.001，图7，表2)。

ROS检测结果显示，实验组靶向对比剂C60-IONP-GE11+激光组处理细胞后可见细胞内有大量绿色荧光，而单纯激光组、C60-IONP-GE11无激光组未见明显绿色荧光，非靶向对比剂C60-IONP-RP+激光处理细胞后细胞内见少量绿色荧光，并且随对比剂浓度的增加，实验组细胞内绿色荧光增多(图8)。对荧光染色结果进行半定量分析(图9)，实验组靶向对比剂C60-IONP-GE11+激光组与单纯激光组、C60-IONP-GE11无激光组、非靶向对比剂C60-IONP-RP+激光组的ROS荧光强度差异具有统计学意义(F=2288.539，P<0.001)。

图6 不同浓度的C60-IONP-GE11细胞毒性实验。 图7 各激光组处理后MDA-MB-231的细胞存活率及统计分析结果。A为单纯激光组，B为C60-IONP-GE11无激光组，C为C60-IONP-RP激光组，D为C60-IONP-GE11激光组。 图8 a)单纯激光组；b)C60-IONP-GE11无激光组；c)C60-IONP-RP激光组；d)200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组；e)400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组；f)800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组处理后MDA-MB-231细胞的活性氧检测图(激光共聚焦扫描显微镜下×2000，标尺为20 μm)。

图9 A)单纯激光组；B)C60-IONP-GE11无激光组；C)C60-IONP-RP激光组；D)200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组；E)400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组；F)800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光组处理后MDA-MB-231细胞的ROS荧光半定量折线图。

讨 论

近年来，纳米材料技术的兴起为癌症的诊治开辟了新前景，其中以多功能磁性纳米粒子为基础的多模式成像和癌症协同治疗已成为分子影像领域发展的新研究方向之一[9-11]。

GE11是特异性靶向上皮源性肿瘤细胞膜EGFR受体的小分子多肽，序列为YHWYGYTPQNVI[12-13]，本研究为保护小肽功能区活性，在首尾各加上两个氨基酸，构成QKYHWYGYTPQNVIQK；GE11内化但不激活EGFR，犹如天然的表皮生长因子配体，从而避免促进肿瘤生长[6]。EGFR是位于细胞膜表面的跨膜糖蛋白[14]，过表达于各种上皮来源的肿瘤，包括非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌等[15]。免疫荧光实验结果显示MD-MBA-231细胞膜表面产生大量红色荧光，表明MD-MBA-231细胞的EGFR表达量多，与文献报道一致[16]，这是我们选择MD-MBA-231细胞株进行体外MRI成像及PDT治疗原因。

C60-IONP-GE11的TEM图示制备的纳米颗粒尺寸均一，水合粒径约29.4 nm，当纳米颗粒粒径在10～100 nm区间时，肝脾网状内皮系统对其的吞噬减少[17]，体内血液循环的时间延长，进一步增加了肿瘤病灶对USPIO的有效结合时间和摄入时间[18]。FTIR各峰可见C60特征峰，Fe-O峰，酰胺键特征峰，GE11共振峰，表明C60和GE11被偶联在磁性颗粒的表面。饱和磁化强度随外加磁场的变化而变化，磁饱和度约为53.4 emu/g，几乎无磁滞现象，呈现超顺磁性，可用于MRI成像。

超顺磁性氧化铁纳米粒可作为磁共振成像的阴性造影剂，即在T2加权像中显示为低信号[19]。MD-MBA-231与C60-IONP-GE11孵育后，PBS洗去未结合的对比剂，当C60-IONP-GE11在浓度为100 μg/mL时，MD-MBA-231细胞开始出现T2信号的负性强化，当浓度升至200 μg/ml时T2信号已接近背景值，随浓度增高T2信号负性强化增强，表明C60-IONP-GE11可体对乳腺癌细胞靶向成像；普鲁士蓝染色实验显示靶向组细胞明显蓝染，而对照组未见染色。YANG等[20]用GE11肽修饰USPIO，与EGFR高表达H1299人非小细胞肺癌细胞孵育后普鲁士蓝染色可见细胞明显蓝染，腋下荷瘤裸鼠MR成像结果显示，尾静脉注射1 h后肿瘤区域T2信号明显下降；MA等[21]开发AFP和GPC3双抗原靶向的USPIO探针，体外对Hepa1-6小鼠肝癌细胞MR成像，显示实验组T2WI信号下降幅度明显，普鲁士蓝染色显示细胞明显蓝染；ZHAO等[22]合成适配体(aptamer，Apt)介导的超小超顺磁性铁纳米粒子(Ultrasmall superparamagnetic iron ox-ide，USPIO)探针，MR体外T2WI成像显示Apt-USPIO孵育的Huh-7人肝癌细胞信号强度随对比剂浓度升高，T2信号逐渐降低，普鲁士蓝染色试验观察到Huh-7肝癌细胞对Apt-USPIO有特异性摄取；本研究与前人结果基本一致。

CCK-8试剂可被活细胞氧化还原生成可溶性的橙黄色甲瓒，因此培养液颜色的深浅与活细胞成正比，与细胞毒性成反比，通过测定反应产物的OD值即可简便且准确的反映存活细胞的数量。本课题选用CCK8试剂盒检测不同浓度C60-IONP-GE11对MD-MBA-231细胞存活情况的影响，结果显示不同浓度C60-IONP-GE11处理后，随着浓度的增加，MDA-MB-231细胞的存活率稍降低，但均在80%以上，根据细胞毒性评级标准，当细胞存活率>75%时可视为无细胞毒性[23]，故C60-IONP-GE11几乎无毒，可用于后续光动力治疗实验。LI[24]等合成水溶性C60衍生物，在无光照条件下，80 μg/ml、150 μg/ml、300 μg/ml的水溶性C60对SMMC-7721人肝癌细胞的细胞抑制率均在10%以下；FU[25]等发现当IONP浓度为30 μg/ml时，4T1人乳腺癌细胞的细胞存活率仅下降不到10%。

光动力学治疗是指用特定波长的激光照射吸收了光敏剂的靶组织，产生单线氧、活性氧杀伤病变细胞而正常细胞不受影响[26]，其发生条件有三个：适宜波长激光、光敏剂、氧气[27]。ROS产生过多，细胞则进入氧化应激状态，从而激发肿瘤细胞损伤、肿瘤血管破坏等杀伤效应[28-30]。PDT治疗肿瘤的机制主要包括Ⅰ型反应(产生活性氧)和Ⅱ型反应(产生单线态氧1O2)[31]。C60作为一种新兴的光敏剂，被广泛应用于光动力治疗，C60光动力治疗更倾向于发生Ⅰ型反应产生活性氧物质[32,33]，因此细胞内活性氧水平是评价C60用于PDT治疗效果的重要指标。

活性氧检测试剂盒是一种利用荧光染料DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒，无荧光的DCFH-DA进入细胞后可被活性氧氧化成有荧光的DCF，通过观察DCF的荧光强度可检测细胞内活性氧的生成水平，本课题通过观察细胞活性氧生成水平来检验PDT治疗实验结果。单纯给予光照组和单独给与C60-IONP-GE11孵育的MD-MBA-231 细胞活性氧检测阴性，说明这两组无光动力学治疗反应发生；而C60-IONP-RP激光组细胞活力稍下降，可能是C60-IONP-RP与MD-MBA-231 细胞发生少量非特异性结合，C60在激光作用下产生少量活性氧使细胞存活率稍降低，活性氧检测证实了少量绿色荧光存在。与对照组相比，C60-IONP-GE11激光组细胞存活率仅为(22.79±4.11)%，细胞活力明显下降 ，杀伤肿瘤细胞效果最显著(P<0.05，具有统计学意义)，且活性氧检测实验显示大量绿色荧光存在，而且C60-IONP-GE11浓度增加，活性氧产生增多，光动力治疗效果增强，进一步证明了C60-IONP-GE11用于光动力治疗肿瘤的可行性。SHI等[34]开发了C60-IONP-PEG-FA，体外光动力治疗可使(73.7±1.3)%的乳腺癌细胞MCF-7发生凋亡。SHI等[35]发现15 μg/ml的C60@Au-PEG光动力治疗MCF-7细胞时，可使其细胞存活率下降至(42.8±5.2)%。Yang等[20]开发Ge11-PDA-Pt@USPIOs纳米粒子，GE11特异性靶向EGFR阳性细胞，激光照射后可使H1299人非小细胞肺癌细胞产生大量ROS荧光，均与本研究结果类似。

综上所述，C60-IONP-GE11多功能MR对比剂兼具磁共振成像与光动力靶向治疗作用，有望同时解决肿瘤靶向MR成像和治疗的问题，具有良好应用前景。