高效液相色谱法测定染发剂中4 种限用成分

李丽，杨样，孙姗姗，王文强，钱凯，邹洁

（江苏省产品质量监督研究院，江苏南京 210007）

目前文献报道的染发剂检测方法主要有高效液相色谱法[1]、液质联用法[2，3]、气相色谱 法[4]、气质联用法[5]及毛细管电泳法[9]等。其中液相色谱-质谱法应用最为广泛，但质谱仪器成本较高，且在分析复杂样品及成分含量未知的样品时， 易造成离子源污染；气相色谱、气质联用和毛细管电泳法在分析复杂样品时易造成对毛细管柱和仪器污染，定性和定量不准确； 而高效液相色谱法具有仪器普及率较高、灵敏度高以及分析速度快等特点。由于染料成分具有极性强，不易挥发，不稳定等特点，因此高效液相色谱法是目前优先选择的检测手段。染发剂中2,6-二羟乙氨基甲苯、3-硝基对羟乙氨基酚、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚、5-氨基-4-氯邻甲酚4 种限用物质的检测方法， 目前国家暂未出台统一的检测标准，文献报道也不多见，存在检测方法缺失、职能部门无法监管的现象，因此本研究采用高效液相色谱法检测染发剂中4 种限用物质，并利用此方法对市售染发剂产品进行检测，为化妆品的市场监督提供技术支持[6～9]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC1260 高效液相色谱仪 （Agilent 公司，美国）；电子分析天平（赛多利斯，德国）；超纯水机（Millipore，美国）；超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，中国）；高速冷冻离心机（Thermo Fisher，美国）；涡旋振荡器（其林贝尔，中国）；4 种限用物质：2,6-二羟乙氨基甲苯（CAS：149330-25-6）、3-硝基对羟乙氨基酚（CAS：65235-31-6）、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚（CAS：6538-09-4）、5-氨基-4-氯邻甲酚（CAS：110102-86-8），标准品均购于上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈（色谱纯，Merk，德国），样品为市售染发剂。

1.2 标准溶液的配制

精确称取2,6-二羟乙氨基甲苯、3-硝基对羟乙氨基酚、5-氨基-4-氯邻甲酚2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚4 种标准品各100mg（精确到0.1mg）分别置于10mL 棕色容量瓶中，加入1mL 亚硫酸氢钠（2g/L）和40%乙腈-水溶液使溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量分数为1.0g/L 的标准储备溶液。将标准储备溶液依次稀释成质量分数为5mg/L、10mg/L、20 mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L 的 系列混合标准溶液。

1.3 样品处理

称取样品0.5g（精确至0.001g），置25.0mL 离心管中，加入1mL 亚硫酸氢钠（2g/L），少量40%乙腈-水溶液，混匀样品后定容至刻度，涡旋30s 并冰浴超声提取15min 后，以10000rpm/min 转速离心8min，经0.45μm 微孔滤膜过滤后，待测备用。

1.4 色谱条件

色谱柱：AgilentEclipseplusC18 （250mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈和20mmol/L 磷酸二氢钾水溶液，4 种限用物质混合标准溶液色谱图见图1；梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；流速：1.0mL/min；检测波长：250nm；柱温：25℃；进样量：10μL，采用外标法定量。

图1 4 种限用物质混合标准溶液的高效液相色谱图

表1 4 种限用物质的梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的优化

标准方法中规定取样量为0.5g， 提取溶剂为10mL50%乙醇水溶液。 按照标准方法在日常检验中发现：部分样品提取液会乳化或凝结，离心后的上层液较混浊，难以通过0.45μm 微孔滤膜；此外，在部分样品配方中未见加入亚硫酸氢钠或异抗坏血酸，制得的供试溶液容易氧化分解，影响测定结果。 为了消除染发剂中增稠剂和凝胶剂的影响，防止供试溶液被氧化，本方法加入硅藻土吸附增稠剂和凝胶剂， 并在提取溶液中加入1mL亚硫酸氢钠（2g/L），提取溶液体积改为25mL 并在冰浴环境中超声提取。 优化后的前处理方法乳化凝结现象明显减少，便于离心后取得上层清液。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 流动相选择 本实验以20mmol/L 磷酸二氢钾水溶液（pH=4.0）作为流动相A 相，考察以甲醇或乙腈（B 相）作为有机相在相同梯度洗脱条件下4 种目标化合物的色谱行为。 结果表明：当以甲醇为有机相时，4 种目标化合物出现出峰时间缓慢、出峰延迟的现象，而以乙腈为有机相出峰时间快并能很好的分离各目标组分，且峰形尖锐对称，故本方法选择乙腈作为有机相。

2.2.2 测定波长的选择 分别对4 种限用物质标准溶液进行紫外-可见光全波长扫描分析 （190～400nm）。 根据所测结果4 种目标物在250nm 左右区域都有吸收峰，因此本方法最终确定定量检测波长为250nm。

2.2.3 色谱柱温度的选择 色谱柱的温度对于4种染发剂限用物质的色谱保留行为及分离效果都具有一定的影响。 本研究考察了当色谱柱温度在10～40℃范围对色谱行为的影响。 实验结果表明：当色谱柱温度为25℃时，既保证了保留时间的稳定性， 同时也避免温度过高引起目标化合物成分的变化， 因此本方法最终确定25℃为色谱柱温。

2.3 方法的线性关系和定量限

将混合标准储备溶液逐级稀释得到的质量分数为5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的混合标准工作溶液，按测定条件质量分数由低到高依次进样分析，以4 种染发剂限用物质的峰面积作为纵坐标， 质量分数作为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程。 4 种限用物质的线性回归方程、线性回归系数、检出限(S/N＞3)及定量下限(S/N＞10)结果见表2。 结果表明：在5～200mg/L 质量分数范围内，各染发剂限用物质的峰面积和对应的质量分数具有良好的线性关系，相关系数均大于0.999，且本方法的检出限完全满足实际样品的分析要求。

表2 4 种限用物质的线性方程、线性相关系数、检出限及定量限

2.4 方法的回收率和精密度

利用空白基质进行回收率和精密度的考察。在低、中、高3 个加标水平下，每个加标水平平行测定6 次，结果表明4 种限用物质的平均回收率范围在87.6%～97.5%，相对标准偏差范围在1.18%～4.64%，RSD 均小于5%（见表3），说明该方法的准确度、精密度均好。

表3 4 种限用物质的加标回收率和精密度结果(n=6)

2.5 样品的测定

本次实验共购买10 种染发剂，利用本文建立的方法进行检测，10 种样品中均未检出4 种限用物质染料，符合《化妆品安全技术规范》（2015 年版）规定。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱法测定染发剂中4种限用物质的检测方法。 该方法前处理简单、重现性好、灵敏度高，可用于染发产品中常用染料成分的测定，为市场监管提供强有力的技术手段支撑。