β-谷甾醇缓解LPS诱导的急性肺损伤大鼠炎症反应和纤维化*

周强 张坤 李富强 刘伟 王鑫

(1. 邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001；2. 阳信县中医院，山东 滨州 251800；3. 滨州市第二人民医院，山东 滨州 256800)

急性肺损伤是常见的危重疾病之一，具有较高的致残率和病死率，随着人口老龄化问题、环境污染的加剧，急性肺损伤的发病率也逐渐升高，严重威胁人类的生命健康[1]。尽管抗微生物治疗和支持治疗取得了长足的进步，但急性肺损伤仍缺乏有效的治疗手段[2]。目前，急性肺损伤的发病机制尚不完全清楚，但普遍认为炎症反应和纤维化在急性肺损伤的发生发展中有重要作用，因此，基于炎症反应和纤维化，探索急性肺损伤的治疗药物具有指导性意义[3-4]。β-谷甾醇(β-sitosterol)属于四环三萜类化合物，具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生理活性[5-6]。Zhou等[7]研究显示，β-sitosterol可阻断RIG-1和IFN/STAT信号，改善甲型流感病毒诱导的急性肺损伤。但β-sitosterol在急性肺损伤中是否还有其他生物效用仍不清楚，故本研究建立脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤大鼠模型，观察不同剂量β-sitosterol处理对急性肺损伤大鼠炎症反应和纤维化的影响，旨在为急性肺损伤的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 清洁级、健康、雄性SD大鼠60只，6～8周龄，体质量200～240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK (京)2019-0013，本研究已通过动物伦理委员会批准。

1.1.2 药品与主要试剂 β-sitosterol、LPS、TUNEL试剂盒(美国Promega)、白细胞介素(IL-1β、IL-4、IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)、天狼星红染液(武汉博士德生物工程有限公司)、Ki67、半胱天冬酶3(Caspase-3，Cas-3)、切割后cas-3(cleaved Cas-3)、iNOS、IL-4、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、转化生长因子β(TGF-β)及纤维连接蛋白(FN)单克隆抗体(美国Abcam)。

1.2 方法

1.2.1 急性肺损伤模型的构建 腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，于颈部正中切口，分离皮下组织，充分暴露气管，沿近心端刺入气管，注入5 mg/kg LPS构建急性肺损伤模型，参考文献标准判断造模是否成功[8]。

1.2.2 动物分组、给药与样本采集 将60只SD大鼠随机分为五组：健康对照组、模型组、模型+β-sitosterol组(5、10、20 mg/kg)，每组12只。模型组和模型+β-sitosterol组采用LPS法构建急性肺损伤模型，健康对照组以等体积生理盐水替代。建模成功后，模型+β-sitosterol组分别灌胃5、10、20 mg/kg β-sitosterol[9]，1次/d，连续灌胃14 d，健康对照组和模型组以等体积生理盐水替代。给药结束后，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，3000 r/m离心10 min，分离上层血清冻存于-80℃冰箱。断颈法处死大鼠，快速分离肺组织，部分固定于4%多聚甲醛，剩余冻存液氮罐。

1.2.3 肺组织TUNEL染色观察 取固定肺组织，制备石蜡切片(8 μm)，滴加蛋白酶K工作液孵育15 min，再添加封闭液室温下孵育10 min，封闭内源性过氧化酶，滴加TdT酶反应液，37℃反应60 min，接着滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反应30 min，然后滴加DAB工作液显色反应10 min，0.5%甲基绿复染10 min，光镜下观察并拍照，胞核呈棕黄色指示为凋亡细胞。

1.2.4 外周血炎性因子含量的检测 取血清样品和ELISA试剂，室温下平衡温度后，参照试剂盒说明书操作，检测血清IL-1β、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS的含量。

1.2.5 肺组织天狼星红染色观察 取固定肺组织，制备石蜡切片(8 μm)，进行常规天狼星红染色(天狼星红染色60 min，再添加Mater苏木素染色45 s)，光镜下观察肺组织病理变化和胶原分布情况。

1.2.6 肺组织western blotting检测 取冻存肺组织提取总蛋白，经BCA法定量检测后，与5×上样缓冲液混匀，沸水浴中变性5 min，配制10%分离胶+5%浓缩胶，取50 μg蛋白上样电泳分离，再湿转至PVDF膜，取出PVDF膜浸没于含有5%脱脂奶粉的封闭液中，室温下轻摇2 h，再孵育蛋白一抗(稀释比为1：1000)，4℃下轻摇过夜，接着孵育蛋白二抗(稀释比为1：10000)，37℃下轻摇1 h，最后添加ECL化学发光、胶片曝光。以目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示Ki67、iNOS、IL-4、α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相对表达量，以cleaved Cas-3/Cas-3比值表示活化Cas-3水平。

1.2.7 肺组织RT-PCR检测 取冻存肺组织提取总RNA，逆转录合成cDNA，再进行荧光实时定量PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性60 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共40个循环。各基因引物序列[10]见表1，以GADPH为内参，采用2-△△Ct法，计算iNOS和IL-4 mRNA的相对表达量。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织TUNEL染色结果的比较 光镜下，健康对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁薄、间隔正常，肺组织内几乎没有凋亡细胞；模型组大鼠肺泡间隔增厚、结构紊乱，并伴有大量凋亡细胞；β-sitosterol组也存在肺泡间隔增厚、肺泡结构紊乱和细胞凋亡现象，但10、20 mg/kg β-sitosterol组肺泡间隔增厚、肺泡结构紊乱程度轻于模型组，凋亡细胞数少于模型组。见图1。

2.2 各组大鼠肺组织中Ki67和Caspase-3表达的比较 与健康对照组比较，模型组肺组织中Ki67蛋白的相对表达量下调，cleaved Cas-3/Cas-3水平上调(P<0.05)；与模型组比较，10、20 mg/kg β-sitosterol组Ki67蛋白的相对表达量上调，cleaved Cas-3/Cas-3水平下调(均P<0.05)。见图2。

2.3 各组大鼠炎性因子水平的比较 与健康对照组比较，模型组外周血IL-1β、TNF-α、iNOS、IL-4、IL-10、肺组织中iNOS、IL-4 mRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05)；与模型组比较，10、20 mg/kg β-sitosterol组外周血IL-1β、TNF-α、iNOS、肺组织中iNOS mRNA及蛋白的表达均下调，外周血IL-4、IL-10、肺组织中IL-4 mRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05)。见图3、图4。

2.4 各组大鼠肺组织天狼星红染色结果的比较 光镜下，健康对照组肺泡细胞结构正常，肺泡间隔均匀，无纤维化现象；模型组肺泡细胞结构紊乱，肺泡壁增厚(纤维病变后加粗)，伴有大量的炎性细胞浸润；10、20 mg/kg β-sitosterol组上述病变较模型组明显减轻。见图5。

2.5 各组大鼠肺组织纤维化标记物表达水平的比较 与健康对照组比较，模型组肺组织中α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相对表达量均上调(P<0.05)；与模型组比较，10、20 mg/kg β-sitosterol组α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相对表达量均下调(P<0.05)。见图6。

3 讨论

天然的植物甾醇及相关化合物约有250种，可从玉米、大豆等植物中提取，具有较高的营养价值，其中β-sitosterol的含量最为丰富，约占所有天然的植物甾醇的50%～65%[11-12]。β-sitosterol的药理活性十分丰富，Rajavel等[13]研究显示，β-sitosterol可诱导肺癌细胞A549的凋亡，可能通过靶向Trx/Trx1轴诱导活性氧的积累，损伤线粒体，激活p53的表达。Feng等[14]分析结果显示，β-sitosterol可降低人体血浆胆固醇水平，预防非酒精性脂肪性肝病。严宁等[15]研究显示，β-sitosterol可能参与ERK1/2信号通路，缓解心肌缺血再灌注大鼠出现的氧化应激和炎症损伤，并抑制心肌细胞的凋亡，从而保护大鼠心肌缺血再灌注损伤。Ilaria等[16]通过分离β-sitosterol处理囊性纤维化支气管上皮细胞，发现β-sitosterol可控制细胞中趋化细胞因子基因的表达，减轻过度的炎症反应。但β-sitosterol在急性肺损伤方面的研究仍处于起步阶段。

迄今为止，急性肺损伤的发病机制尚未完全明了，除了致病因素对肺泡-毛细血管屏障的直接损伤外，多种炎性细胞及因子介导的肺内炎症反应，导致肺组织出现水肿、肺不张等实质性损伤，直接影响肺功能，同时凝血系统紊乱、纤溶代谢失衡、氧化应激、细胞凋亡、纤维化等会持续加重肺损伤，并形成恶性循环[17-19]。本研究结果显示，与健康对照组比较，模型组大鼠肺组织中TUNEL阳性染色细胞数增多，活化的凋亡因子Cas-3水平提高，增殖细胞抗原Ki67表达降低，给予β-sitosterol处理后，凋亡细胞减少，Ki67表达上调，cleaved Cas-3/Cas-3水平下调，提示β-sitosterol可能通过上调Ki67、抑制凋亡因子Cas-3的活化，抑制急性肺损伤大鼠肺组织细胞的凋亡。这与Lin等[20]报道β-sitosterol在心肌缺血再灌注损伤中的抗凋亡作用相似。多项研究表明，β-sitosterol具有较高的抗炎活性[21-22]，本研究中，β-sitosterol可有效降低急性肺损伤大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS水平，提高抑炎因子IL-4和IL-10水平，表明β-sitosterol在急性肺损伤中的抗炎作用，可能是其保护作用途径之一。另外，Park等[23]研究指出，β-sitosterol可通过抑制TGF-β1/Snail途径，抑制上皮间质转化，从而减轻肺纤维化。研究显示，急性肺损伤后早期肺纤维化的发生与进展中，TGF-β有重要作用，LPS刺激提高TGF-β表达，进一步活化成纤维细胞，诱导多种促纤维化细胞因子的分泌(α-SMA等)，导致细胞外基质(FN等)的过度累积[24-26]。本研究发现，β-sitosterol可减轻LPS诱导的肺组织纤维化程度，降低纤维化标记物α-SMA、TGF-β及FN蛋白的表达，提示β-sitosterol在急性肺损伤中具有抗纤维化作用。

4 结论

β-sitosterol可改善LPS诱导的急性肺损伤，可能为通过上调Ki67、抑制凋亡因子Cas-3的活化，抑制肺组织细胞凋亡；降低急性肺损伤大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS水平，提高抑炎因子IL-4和IL-10水平，降低炎症反应；降低纤维化标记物α-SMA、TGF-β及FN蛋白的表达，减轻纤维化。但β-sitosterol是否还有其他途径作用于急性肺损伤，仍有待进一步深入研究。