基于TLR4/MyD88/NF-κB通路异甘草素对大鼠颅脑外伤后炎症反应及Th1/Th2失衡的影响*

2022-06-20孙博蕊孙杰瑜李志鹏苏志强

西部医学 2022年6期

孙博蕊孙杰瑜李志鹏苏志强

(1. 中国医科大学附属第一医院手术室，辽宁沈阳 110000；2. 中国医科大学附属第一医院肾内科，辽宁沈阳 110000；3. 中国医科大学附属第一医院神经外科，辽宁沈阳 110000；4. 哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，黑龙江哈尔滨 150000)

颅脑外伤(Traumatic brain injury，TBI)是由外力作用引起的正常大脑功能损伤，主要由跌倒、暴力和交通事故等造成，是45岁以内成人致残和死亡率高的首要原因[1]。尽管大多数神经损伤是有限和暂时性的，TBI仍留有多种后遗症，包括睡眠障碍、垂体功能减退、癫痫以及神经退行性疾病[2]。事实上，TBI被广泛认为是神经退行性疾病的危险因素，其特征为神经元或髓鞘缓慢进行性丧失和残疾增加(如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症等)，值得注意的是，不同类型TBI患者患神经退行性疾病的风险往往会增加[3]。苷草是一种多年生草本豆科植物，以根或根茎入药，富含甘草苷、三萜皂苷、异甘草素(Isoliquiritigenin，ISL)等多种有效成分[4]。ISL提取自甘草根部，是一种具有查尔酮结构的黄酮类化合物[5]，具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等药理活性，且能扩张动脉，起到保护心脏和大脑作用[6]。研究表明，ISL能降低糖尿病神经病变大鼠氧化损伤，并可降低核转录因子-κB (Nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB)活性发挥对脓毒症小鼠脑损伤的保护作用[7]。此外，ISL可通过抑制氧化应激降低缺血再灌注所致的损伤[8]。本研究通过建立TBI模型，初步探讨ISL对TBI大鼠的影响，为ISL相关药物研发及临床治疗TBI提供新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物选取60只SPF级雄性健康大鼠，体质量(200±20)g，8周龄，购自上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可：SCXK (沪)2018-0004，购入后保持室内温度(24±1)℃，空气相对湿度(60±10)%，光照昼夜交替循环12 h，室温下饲养1周。本研究通过医院动物伦理委员会审核同意。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器异甘草素，纯度98%，北京solarbio科技有限公司；甘油果糖氯化钠注射液，国药准字：H20055446，扬子江药业集团有限公司；IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-αELISA试剂盒，美国Sigma公司；蛋白BCA试剂盒，美国R&D公司；兔抗Toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR4)TLR4单抗、髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)单抗、核转录因子-κB p65(Nuclear transcription factor-kappa B p65，NF-κB p65)单抗、磷酸化核转录因子-κB p65(P-hosphorylated nuclear transcription factor-kappa B p65，p-NF-κB p65)单抗、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单抗，羊抗兔二抗-HRP，英国Abcam公司；重锤击打装置，徐州电子技术开发有限公司；电泳仪、垂直电泳槽，美国Satan Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 建模和分组随机选取50只大鼠术前禁食禁水8 h，腹腔注射体积分数为1%的戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)麻醉，待麻醉生效后，将大鼠俯卧并固定于脑立体定向仪，剃除术区毛发、消毒，无菌环境下沿中线矢状位切开头部，剥离骨膜，暴露中线颅顶骨，采用牙科钻在冠状缝后、中线旁区域钻打骨窗(直径5 mm左右，且硬膜完整)，使用重锤击打装置进行击打，选择40 g的圆柱形击锤，高度为20 cm，自由落体击打骨窗，致使大鼠颅脑损伤，撞击后在大鼠脑部切口处滴入硫酸庆大霉素(40000 U，4～5滴)预防伤口感染，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮后放回饲养笼饲养(25℃恒温)，并自由进食水。当大鼠呼吸出现数秒暂停、四肢抽搐、且麻醉失效后无偏瘫等现象，即为造模成功[9]。取建模成功后40只大鼠(6只死亡，4只无任何症状)随机分为模型组、ISL低剂量组、ISL高剂量组、阳性药物组，每组10只；另取10只大鼠作为对照组，不进行任何击打处理。

1.2.2 干预方法建模成功后24 h，参照文献[4]用量，ISL低剂量组、ISL高剂量组、阳性药物组分别给予20 mg·kg-1、40 mg·kg-1异甘草素溶液及20 mg·kg-1甘油果糖氯化钠注射液120 μL，给予对照组与模型组等量生理盐水，1次/d，共计6周。

1.2.3 标本采集末次给药后24 h，抽取大鼠腹部主动脉血，离心取血清，-20℃冰箱保存备用。处死大鼠，无菌剥离脑组织，一部分置于体积分数4%多聚甲醛固定备用，余下-80℃存储备用。

1.2.4 血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量测定取-20℃保存备用血清，离心取上清(5000 r·min-1，10 min，离心半径20 cm)，ELISA法检测IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量。抗体包被过夜(100 μL，37°C，60 min)、洗涤，加待测样品(100 μL，37℃，60 min)、洗涤，加入酶标抗体(0.1 mL，37℃，1 h)、洗涤，加底物液避光显色(90 μL，37℃，15 min)，添加终止液停止反应(50 μL)，酶标仪测定450 nm处吸光度值，根据标准曲线计算大鼠血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量。

1.2.5 脑组织病理学变化观察取4多聚甲醛固定备用脑组织，石蜡包埋，切片4 μm，65℃加热30 min，脱蜡20 min，苏木精染色3～5 min、清洗、体积分数1% H2O2浸泡10～30 s，水洗、伊红染色20 min，水洗，酒精脱水10 min，二甲苯透化10 min，中性树脂封固，光学显微镜观察。

1.2.6 脑组织TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA检测取-80℃存储备用1/2脑组织，匀浆，Trizol法提取RNA，测定纯度、浓度，逆转录得cDNA，实时荧光定量PCR反应。反应体系：1.5 μL Taq聚合酶、1 μL上下游引物、4 μL模板cDNA、13.5 μL ddH2O。扩增条件：预变性(95℃，30 s)、变性(95℃，5 s)、退火(59℃，30 s)，共40个循环，加熔解曲线，降温(50℃，30 s)。以GAPDH作为内源对照，数据分析采用2-△△Ct法，重复多次，取Ct均值。引物序列，见表1。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.7 脑组织TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白检测取-80℃存储备用1/2脑组织，加RIPA裂解缓冲液，离心(6000 r·min-1，10 min，离心半径20 cm)，取上清，蛋白BCA试剂盒确定总蛋白浓度，将待测蛋白样品进行电泳分离(100V，80 min)，转至PVDF膜(250 mA)，用50 g·L-1脱脂牛奶封闭2 h，将样品与TLR4(1：200)、My D88(1：500)、NF-κB p65(1：1000)、p-NF-κB p65(1：1000)一抗进行孵育(4℃，24 h)，TBST缓冲液洗膜，加二抗室温孵育(HRP标记IgG，1：5000，2 h)，洗膜，曝光，显影。Image J软件测样品条带与GAPDH条带灰度值。目标蛋白相对表达水平计算，即目标条带与GAPDH条带灰度比值。

2 结果

2.1 IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平比较各组血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平组间比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。与对照组比较，模型组血清IL-1β、IL-4、TNF-α水平升高，IFN-γ水平降低(P<0.05)；与模型组比较，ISL低剂量组、ISL高剂量组、阳性药物组血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)；与ISL低剂量组比较，ISL高剂量组、阳性药物组血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)；与ISL高剂量组比较，阳性药物组血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)。见表2。

表2 血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平比较Table 2 Comparison of serum IL-1β，IL-4，IFN-γ and TNF-α levels

2.2 脑组织病理学观察 HE结果显示，对照组脑组织神经元细胞结构清晰、分布均匀、脑皮质厚度适中，位于中央的核仁大且圆；模型组出现大量脑组织神经元变性、坏死，数量减少，体积缩小，脑皮质厚度变薄，细胞核发生移位、结构模糊，核仁消失。ISL低剂量组、ISL高剂量组、阳性药物组脑组织神经元损伤较模型组均出现不同程度改善，其中ISL高剂量组、阳性药物组改善显著，神经元细胞数量减少、体积缩小，脑皮质厚度变薄，细胞结构相对较清晰。见图1。

2.3 TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA水平比较各组脑组织TLR4、My D88 mRNA水平组间比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。与对照组比较，模型组脑组织TLR4、My D88 mRNA水平升高(均P<0.05)；与模型组比较，ISL低剂量组、ISL高剂量组、阳性药物组脑组织TLR4、My D88 mRNA水平降低(均P<0.05)；与ISL低剂量组比较，ISL高剂量组、阳性药物组脑组织TLR4、My D88 mRNA水平降低，且阳性药物组低于ISL高剂量组(均P<0.05)。见表3。

表3 脑组织TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA水平比较

2.4 TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白水平比较各组脑组织TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平组间比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。与对照组比较，模型组脑组织TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平升高(均P<0.05)；与模型组比较，ISL低剂量组、ISL高剂量组、阳性药物组脑组织TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低(均P<0.05)；与ISL低剂量组比较，ISL高剂量组、阳性药物组脑组织TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低，且阳性药物组低于ISL高剂量组(均P<0.05)。见图2、表4。

表4 TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白水平比较Table 4 Comparison of protein levels of TLR4，My D88，NF-κB p65，and p-NF-κB p65

3 讨论

TBI是一种高度异质性损伤，可导致一系列暂时或永久性神经系统改变，其主要病理特征为神经炎症、氧化应激、兴奋性毒性和线粒体功能障碍等[10]。TBI又被认为是一种“双相损伤”，即原发性损伤和延迟的继发性损伤。原发损伤是指由机械损伤直接引起的即刻损伤，包括轴突剪切、出血和挫伤，并依据不同损伤严重程度分为轻度、中度和重度[11]。而继发损伤是指由于原发损伤引发病理生理变化进而引起的进一步损伤，包括线粒体功能障碍、氧化损伤和神经炎症在内的分子过程构成的神经元损伤和退化[12]。TBI病理过程复杂，不仅涉及到外力间接或直接作用引起的损伤，之后继发的神经元细胞微观结构的改变，可导致神经元凋亡或死亡，引起神经功能障碍。迄今为止，尽管众多学者对TBI进行了大量的基础与临床研究，但具体作用机制尚不清晰。

神经炎症是中枢神经系统对损伤反应的主要病理生理特征，包括炎性细胞浸润、促炎细胞因子表达、小胶质细胞活化等[13]。TNF-α是一种重要炎性介质趋化因子，能够诱导细胞浸入炎症局部，进而加重炎症浸润导致组织损伤；IL-1β作为一级炎症细胞因子，能够促进炎细胞活性[14-15]。IFN-γ、IL-4分别体现Th1、Th2型淋巴细胞主要生物学效应，常被用于细胞免疫功能的检测指标，一般情况下，机体自身Th1/Th2细胞处于相对平衡状态，一旦机体免疫功能发生异常，其相对平衡状态遭到破坏，进而导致Th1/Th2细胞失衡[16]。本研究结果发现，与模型组比较，ISL低、高剂量组大鼠血清IFN-γ水平升高、TNF-α、IL-1β、IL-4水平降低，炎性反应得以改善。HE结果显示，ISL低、高剂量组脑组织神经损伤较模型组均出现不同程度改善，其中ISL高剂量组脑组织神经损伤改善明显，与阳性药物组效果相当，揭示经ISL干预后，Th1/Th2比值升高，Th1/Th2细胞免疫平衡得以修复，能有效抑制相关炎性因子释放进而减轻炎性反应及组织结构破坏，表明ISL可通过调节Th1/Th2细胞平衡，改善TBI大鼠炎性反应，减轻脑组织损伤。

TLRs属于跨膜蛋白家族受体，在非特异性或先天免疫防御中起关键作用。所有TLR家族成员中，TLR4在小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞、内皮细胞等中枢神经系统中广泛表达[17]。MyD88是TLR4的关键衔接蛋白，可激活下游NF-κB因子以及与神经毒性有关的促炎细胞因子。TLR4将细胞内IL-1β同源域激活，通过介导下游信号分子MyD88激活NF-κB效应因子，其中NF-κB易转位为核磷酸化，调节免疫炎症因子表达[18]。已有研究[19]证实，经外部刺激后，生物体发起先天性免疫应答，TLR4表达上调，并激活NF-κB通过MyD88的依赖性信号传导途径B，从而导致严重的异常肠黏膜上皮炎症。此外，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导促炎细胞因子的释放并诱导神经元变性和细胞凋亡[20]。Wang等[21]研究证实，在TBI小鼠模型中，雌二醇可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减少神经毒性，减轻神经炎性损伤[21]。Huang等[22]发现，右美托咪定可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻炎症反应，发挥神经元保护作用。以上研究均表明TLR4在TBI中发挥关键作用，本研究结果显示，ISL能显著降低TBI大鼠脑组织TLR4、My D88 mRNA和TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白表达，提示ISL可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路关键分子表达，减轻炎症反应以及脑组织损伤，从而降低机体损害风险。