二苯乙烯苷对大鼠脑缺血再灌注损伤Nalp3、Caspse-1、白介素-18表达的影响

陈 雪 张嫄怡 段文彪

1.肇庆医学高等专科学校病理学教研室，广东肇庆 526020；2. 肇庆医学高等专科学校学校办公室，广东肇庆 526020

脑缺血再灌注损伤是脑组织出现供血中断后再恢复血流灌注时出现的病理损伤过程，其发生机制复杂，主要与钙超载、氧化应激、能量衰竭、炎症凋亡等有关[1]。 脑缺血再灌注损伤，破坏血脑屏障，引起大量炎症因子释放，损伤神经元，继而造成脑功能障碍[2]。炎症小体通路激活后，细胞会进行程序性死亡，细胞焦亡在脑缺血再灌注损伤的神经元损伤中越来越受重视。 二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glucoside，TSG）是中药何首乌中主要的水溶性生物活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗动脉血管硬化、抗衰老和神经保护等作用。 目前对TSG 在脑缺血再灌注损伤动物模型中的研究主要是通过清除自由基、 抗氧化、抑制细胞钙超载等来保护脑神经元细胞，影响神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。 本研究通过建立脑缺血再灌注损伤动物模型， 探索TSG 对受损的海马组织Nalp3、Caspase-1 及IL-18 表达的影响， 探究TSG 抗炎症反应的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

mRNA 提取试剂盒和DNA Marker（天根生化科技有限公司），逆转录试剂盒和PCR 反应体系（莫纳生物科技有限公司），引物（武汉金开瑞生物工程有限公司），TSG（上海士锋生物科技有限公司，批号：178031025），PCR 扩增仪（上海力康生物医疗科技有限公司，T960A），琼脂糖水平电泳槽（北京六一生物科技有限公司，DYCP-31DN），凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，Tanon4100）。 实验所需的仪器由肇庆医学高等专科学校科研平台提供。

1.2 实验分组及模型的制备

健康雄性SD 大鼠，SPF 级，2月龄，体重（200±10）g，购买于广东省医学实验动物中心[许可证号SCXK（粤）2013-0001]，饲养环境温度22～25℃，湿度约55%，明暗交替时间为12 h/12 h，自由摄食，适应性饲养一周。 大鼠随机分为5 组，即假手术组、模型组、TSG 低剂量组、TSG 中剂量组、TSG 高剂量组，每组12 只。 大鼠术前禁食12 h，不禁水。

采用夹闭双侧颈总动脉制备脑缺血再灌注损伤模型。 用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧固定，备皮，手术区域常规消毒后沿颈部正中线作一纵形切开，用玻璃分针小心钝性分离双侧颈总动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉2 h 后，取下动脉夹恢复血流再灌注，缝合皮肤，伤口抗感染处理。假手术组接受相似的手术操作，但不夹闭双侧颈总动脉。 TSG 低、中、高剂量组缺血再灌注后30 min 开始腹腔注射给药，剂量分别为30、60、90 mg/kg、，连续给药7 d，每天给药一次。 假手术组、模型组均采用相同的给药方式给予等剂量的生理盐水。本研究已经过肇庆医学高等专科学校实验动物伦理委员会审核通过。

1.3 脑组织含水的测定

术后第8 天，每组随机选取4 只大鼠，麻醉，断头取脑，舍弃小脑及脑干等，称量脑湿重量，其后把已包裹锡纸的脑组织放于烘箱中烘干48 h 后， 取出再次称量脑重量为干重，计算脑组织含水量，脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.4 大鼠脑组织HE 染色

大鼠麻醉仰卧固定后， 用4%多聚甲醛进行心脏灌注，取出脑组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，取材，脱水，透明，石蜡包埋，常规切片HE 染色，光学显微镜观察各组大鼠脑组织形态学的变化。

1.5 RT-PCR 检测大鼠海马Nalp3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-18 mRNA 的表达

PCR 反应体系（参考PCR 说明书）：Taq Master Mix 25 μl，上下游引物各1 μl（0.4 μmol/L），模板DNA 0.4 μg，加DEPC 水补至50 μl。 PCR 反应条件：预变性94℃，2 min，变性94℃，30 s，退火55～65℃，30 s，延伸72℃，1 min，终延伸72℃，5 min（30 个循环）。 Nalp3 引物序列：正向5′-GAGGAGTGGATAGGTTTGCTG-3′，反向5′-TGGGTGTGACGTCTGTTGAG-3′；Caspase-1 引物序列：正向5′-ACCGAGTGGTTCCCTCAAGT-3′，反向5′-CGTGTACGAGTGGGTGTTTTC-3′；IL-18 引物序列：正向5′-GGCTGCCATGTCAGAAGAAG-3′，反向5′-GCTCCGTATTACTGCGGTTGT-3′。 PCR 反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 用全自动图像分析仪分析电泳结果。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析， 组间两两比较采用LSD-t 检验；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组大鼠海马组织的形态学改变

假手术组大鼠海马区的神经细胞排列整齐致密，形态正常，呈椭圆形，染色匀称，核膜清晰，浅蓝紫色的胞核，可见显著的核仁。 模型组大鼠海马可见明显的神经细胞凋亡，染色变深，细胞核不明显，核质混为一体。 TSG 低剂量组模型组大鼠海马可见大部分神经细胞体积缩小，细胞核染色变深，核固缩明显，神经细胞病理性损伤改善不明显。 TSG 中剂量组模型组及TSG 高剂量组海马组织较模型组的神经细胞损伤程度明显减轻，只见少部分核固缩的改变（图1，封三）。

2.2 五组大鼠脑组织含水量的测定

五组大鼠的脑组织含水量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组及TSG 低、中、高剂量组大鼠的脑组织含水量高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；TSG 中、 高剂量组大鼠的脑组织含水量低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 各组大鼠脑组织含水量的变化（±s）

表1 各组大鼠脑组织含水量的变化（±s）

注 与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；TSG：二苯乙烯苷

组别 n 脑含水量（%）假手术组模型组TSG 低剂量组TSG 中剂量组TSG 高剂量组F 值P 值44444 75.247±2.118 83.981±2.750a 82.306±2.462a 80.120±2.278ab 79.116±2.245ab 7.841＜0.001

2.3 五组大鼠海马区Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表达的比较

五组大鼠海马区的Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）； 模型组大鼠海马区内Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表达水平高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TSG 中、高剂量组大鼠海马Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表达低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 各组大鼠海马区Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA表达的结果（±s）

表2 各组大鼠海马区Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA表达的结果（±s）

注 与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；TSG：二苯乙烯苷；IL-18：白介素-18

组别 n Nalp3 mRNA Caspse-1 mRNA IL-18 mRNA假手术组模型组TSG 低剂量组TSG 中剂量组TSG 高剂量组F 值P 值44444 0.958±0.035 1.243±0.050a 1.186±0.057a 1.111±0.053ab 1.040±0.048ab 21.188＜0.001 0.832±0.034 0.991±0.048a 0.968±0.046a 0.927±0.039ab 0.900±0.038ab 8.983＜0.001 0.824±0.041 1.153±0.054a 1.088±0.052a 1.059±0.051ab 1.029±0.051ab 24.771＜0.001

3 讨论

缺血性脑病的发病率、致残率、死亡率逐年升高，严重危害老年人的生活质量甚至是生命，脑缺血会导致缺血区域相应的功能障碍，目前治疗脑缺血的主要方法是恢复血流灌注[3]。 脑缺血再灌注可通过炎症反应、凋亡、氧化应激等多种损伤机制造成神经细胞不可逆性损伤、脑水肿，其发病机制复杂及未明确，而且目前尚未有有效的治疗方案避免脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤与炎症反应引起的细胞焦亡密切相关，各类炎症因子（IL-18、IL-1β 等）的活化参与了细胞焦亡过程。 细胞焦亡属于炎症程序性细胞死亡，细胞体积不断增大，细胞膜破裂，细胞内容物释放，产生大量的促炎症因子，导致剧烈的炎症反应。 细胞焦亡既可引起细胞的死亡，也可引起组织损伤的级联反应[4]。 细胞焦亡是由Caspse-1 介导的，与炎症反应有关的细胞程序性死亡。炎症因子的过度释放及伴随继发性的炎症反应是脑缺血再灌注损伤恶化的其一重要原[5]。脑缺血再灌注后，受损的细胞功能不但难以恢复，而且，还可激活因缺血产生的炎症因子和过氧化物，导致细胞产生更严重的损伤或者死亡。 通过抑制Caspse-1 的表达来抑制细胞焦亡的发生，减轻缺血再灌注损伤，为治疗缺血再灌注损伤提供新途径。

目前，越来越多的研究发现脑缺血再灌注损伤与神经细胞内的炎症反应密切相关[6]。 Nalp3 炎症小体在脑缺血再灌注损伤神经细胞的损伤中起着重要的作用。 Nalp3 炎症体是研究比较透彻的炎症复合体。Nalp3 参与炎症性疾病， 应激性疾病及免疫性疾病的发生发展[7]。 Nalp3 炎症体是细胞内的一种模式识别受体，是炎症反应的始动因子，在激发及调节炎症反应中具有重要的调控功能，可诱导脑缺血再灌注损伤发生炎症反应， 从而引起神经细胞的损伤及细胞焦亡。Nalp3 在识别危险信号的过程中被激活，招募转接蛋白ASC 及Caspse-1 组装成Nalp3 炎症复合体，从而激活Caspse-1， 激活下游IL-1β 前体及IL-18 前体， 进而引起炎症瀑布反应。 在正常的生理状态下，Nalp3 炎症体处于抑制状态，但容易被激活。当脑缺血再灌注时，会发生氧化应激、钙超载、自由基损伤、微循环障碍等，这些危险信号都可被Nalp3 识别，激活Nalp3 炎症体， 诱导脑缺血再灌注损伤的炎症反应。Nalp3 炎症小体的活化与脑缺血再灌注损伤的损伤紧密相关[8]。 脑缺血再灌注损伤的大鼠脑组织内的炎症反应升高， 减少炎症反应可减轻脑缺血再灌注损伤的损伤程度[9]。 脑缺血时，脑细胞的代谢障碍，能量生成减少，脑细胞出现损伤甚至是死亡。 在本研究中发现模型组大鼠大脑海马神经细胞的损伤严重，细胞体积缩小，可见明显的核固缩的改变，海马中的炎症因子Nalp3、Caspse-1、IL-18 表达升高， 脑缺血再灌注损伤与炎症反应有关。 脑缺血再灌注时，可激活炎症因子，诱发大脑神经细胞的细胞焦亡程序，导致脑细胞死亡[10]。

TSG 是何首乌中的水溶性生物活性有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血脂、神经保护等多种药理作用[11]。 TSG 与白藜芦醇具有相似的结构，仅在二位多一个酚羟基，都属于二苯乙烯类。 白藜芦醇可通过抑制Nalp3 炎症小体活化后沉默调节蛋白1依赖的自噬活动来改善脑缺血再灌注损伤[12]。 在大鼠大脑中动脉闭塞模型中， 病变侧大脑半球Nalp3、Caspse-1、IL-1β 和IL-18 表达上升，并上调自噬活动，减轻脑缺血再灌注损伤中Nalp3 炎症小体引起的炎症反应，下调自噬，减少脑梗死体积、脑水肿减轻[13]。孙玉洁等[14]研究证实白藜芦醇可通过提高大鼠脑组织小胶质细胞的Nalp3 炎症小体、Caspase-1 水平，降低闭锁小带蛋白-1 的水平， 抑制脑缺血再灌注过程中的细胞焦亡，从而保护脑功能。TSG 在关节炎、肠道炎症及脂肪性肝炎中具有良好的抗炎作用[15]。 IL-18在感染性疾病和慢性炎症反应中具有重要的作用[16]。IL-1β 和IL-18 表达升高，可诱导受损伤局部聚集更多的炎症细胞，加重脑组织损伤[17]。 本实验研究中，通过制备脑缺血再灌注损伤动物模型， 给予TSG 腹腔注射干预，发现TSG 中高剂量可减轻脑水肿，降低脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织中的Nalp3、Caspse-1、IL-18 的表达，提高抗炎能力，从而减轻脑缺血再灌注损伤。TSG 能降低Nalp3、Caspse-1 以及IL-18 的表达，减轻炎症级联反应。 王齐等[18]研究发现TSG 可上调脑缺血再灌注沙鼠脑内B 淋巴细胞瘤-2 基因（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）水平，降低P53 和Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）水平，以调节线粒体膜上钙离子的内流来维持完整的线粒体膜，调控氧化应激反应，改善神经细胞凋亡，保护神经细胞。TSG 可抑制小胶质细胞促炎因子的释放，抑制小胶质细胞的活化，减轻炎症损伤作用[19]。 TSG 能通过抑制脑缺血再灌注损伤的脑组织氧化应激蛋白烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 以及凋亡相关蛋白Caspase-3/9 的表达发挥脑神经细胞的保护作用[20]。 TSG可通过抗炎症反应、抗氧化应激损伤、抗凋亡等多种途径发挥其对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。

综上所述，TSG 可抑制炎症因子Nalp3、Caspse-1、IL-18 表达，减少炎症因子的活化，减轻炎症损伤反应，抑制神经细胞焦亡，具有神经保护作用。TSG 可通过多种途径发挥对脑缺血再灌注损伤的神经细胞保护作用，这需要我们更深入的研究，为脑缺血再灌注损伤的防治提供新的方案。