不同青稞品种对7.5%啶磺草胺的耐药性分析

张宇翔，朱 亮，魏有海*

(1.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016； 2.农业部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海 西宁 810016；3.青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁 810016； 4.湖北省十堰市农业科学院/农技中心，湖北 十堰 442000)

在青藏高原传统农业生产中，青稞一直都是优势作物和重要的粮食作物，目前，青稞正从一个地区性口粮作物的形象逐渐向国际性保健食品的形象转变[1-2]。2019年统计结果显示青海省内的青稞播种面积已经达到6.385×104hm2，占青海省粮食播种总面积的22.79%；青稞产量144.10×104kg，占青海省粮食总产量的13.65%[3]。

农田杂草对耕作及防除措施适应力极强，青海青稞田杂草危害率达83.7%，是影响青稞产量提高、品质提升的重要限制因素[4-5]。近年来，由于青稞栽培技术的改变和农业机械跨区作业，致使原来只在青海东部农业区零星发生的旱雀麦，在青稞田迅速蔓延扩散，成为新的恶性难治杂草。在门源县脑山生态区，旱雀麦平均密度达23株/m2[6]。青海大学农林科学院杂草课题组引进小麦田除草剂7.5%啶磺草胺水分散粒剂(WG)用于青稞田防除旱雀麦，取得了良好效果。但农田杂草与作物之间、不同种类作物之间和相同作物的不同品种之间对除草剂的耐药性均有较大差异[7]。苏少泉[8]通过研究发现，植物对除草剂产生的耐药性差异与该除草剂作用的靶标和植物体内代谢酶活性密切相关；董雪等[9]、李亚东等[10]通过试验证明在啶磺草胺作用下，不同小麦品种对其均有明显的耐药性差异。但目前关于不同青稞品种在7.5%啶磺草胺作用时是否具有耐药性差异及耐药性产生原因的研究鲜见报道。面对旱雀麦危害日益严重、除草剂品种匮乏的生产实际，本研究收集了青海不同地区的10个青稞主栽品种，对7.5%啶磺草胺的耐药性水平进行测定，并测定了施药后不同时期靶标酶(ALS)和代谢酶(GSTs)的活性，探讨了青稞品种对除草剂产生耐药性的机理，为科学评价不同青稞品种对7.5%啶磺草胺的耐药性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

(1)供试青稞品种。柴青1号、北青1号、北青2号、北青3号、北青4号、北青5号、北青6号、北青8号、昆仑14号、昆仑15号，由青海大学农林科学院作物研究所提供，均为青海不同地区的青稞主栽品种。

(2)供试除草剂。7.5%啶磺草胺水分散粒剂(WG)，由陶氏益农(中国)有限公司生产。

(3)供试化学试剂。90%黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、99%2，4-二硝基氯苯(CDNB)、97%硫胺素焦磷酸(TPP)、99%肌酸、99%α-萘酚、99%考马斯亮蓝G-250、98%牛血清蛋白(BSA)、95%还原型谷胱甘(GSH)、99%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Tris、3-羟基丁酮、丙酮、丙酮酸钠、MgCl2、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、95%乙醇、85%磷酸、37.5%盐酸、98%浓硫酸，均为国产分析纯。

1.2 试验仪器

紫外分光光度计、 3WPSH-50D型生测喷雾塔(农业农村部南京农业机械化研究所)、高速冷冻离心机(ST 16R)、制冰机、恒温水浴锅、FA1104-B万分之一分析天平。

1.3 不同青稞品种对7.5%啶磺草胺的耐药性测定

本试验在青海大学农林科学院温室进行，采用盆栽法，以体积比2∶1，将砂土和营养土搅拌并混合均匀后装入花盆中(直径10 cm，深8 cm)，每盆播撒20粒青稞种子后覆土3 cm，放入不锈钢盘中，定时定量浇水，待其长至3叶期开始间苗，每盆保留10株长势一致的青稞幼苗备用。

试验设7.5%啶磺草胺施用剂量分别为3.125、6.25、12.5、25、37.5、50、100 g/hm2，共7个处理。根据施用剂量准确称量除草剂后兑水24 mL，使用生测喷雾塔在青稞3叶期从低到高浓度依次喷雾，每个剂量施药后清洗喷雾塔再进行下一个浓度喷雾，并设喷施等量清水为对照，重复4次。

施药后，每天观察各处理青稞的长势、叶色等。施药后14 d测定株高、地上部鲜重，计算各处理的株高抑制率、鲜重抑制率，以抑制率机率值(Y)和浓度对数值(X)建立回归方程(Y=a+bX)，计算青稞幼苗的IC50值、耐药性倍数。

1.4 7.5%啶磺草胺对青稞ALS活力的影响

(1)酶液的提取。在预冷的研钵中加入1.0 g剪碎的青稞叶片(3叶期)，加入酶提取液4 mL(含有1 mmol/L 丙酮酸钠、0.5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L TPP、1.0 μmol/L FAD的磷酸缓冲液)，迅速研磨成匀浆并转移至10 mL离心管，再用4 mL酶提取液冲洗研钵并转入离心管，4 ℃冰箱冷藏10min。于4 ℃、25 000 r/min下离心20 min，取上清液作为粗酶液，向粗酶液缓慢加入硫酸铵晶体至50%饱和度，沉淀2 h 后，4 ℃、25 000 r/min离心30 min，去除上清液，将沉淀用6 mL酶溶解液溶解后待测。

(2)酶活性测定。待青稞幼苗长至3叶期，以7.5%啶磺草胺田间推荐最低量和最高量(12.5 g/hm2和37.5 g/hm2)对茎叶进行喷雾处理，设喷施清水为对照，处理完毕后移入温室，相同条件下继续培养。分别于施药后第1、3、5、7、9、11、13天采集施药和空白对照青稞植株地上部分叶片1.0 g，共采集7次，每次重复4次。参考范志金等[11]的试验方法进行ALS活力测定。可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[12]。设处理组酶活力与对照组酶活力的比值为ALS相对活力。

1.5 7.5%啶磺草胺对青稞GSTs活力的影响

(1)酶液提取。取青稞3叶期叶片1.0 g，剪碎后放入预冷的研钵中，加入8 mL Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L，pH 8.0，含25 mmol/L还原型谷胱甘肽及质量分数为5%的PVP)研磨成匀浆，4 000 r/min离心10 min，取上清液12 000 r/min离心5 min，取上清液做酶液，于4 ℃下保存，待测。

(2)酶活性测定。待青稞幼苗长至3叶期，以7.5%啶磺草胺田间推荐剂量12.5 g/hm2和37.5 g/hm2对茎叶进行喷雾处理，以喷清水为对照，处理完毕后移入温室，相同条件下继续培养。分别于施药后第1、3、5、7、9、11、13天采集施药和空白对照青稞植株地上部分1.0 g，共采集7次，每次重复4次。活性测定在10 mL具塞试管中加入3 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和0.1 mL酶反应液，每管重复3次，于25 ℃保温10 min，加入0.1 mL浓度为13 mmol/L的CDNB溶液，反应10 min，采用紫外分光光度计于340 nm处测OD值，并作为酶活力单位。设处理 OD值与同期对照OD值的比值为GSTs相对活力。

1.6 数据分析

所有数据均使用SPSS19.0进行分析处理，用Excel 2016作图。

2 结果与分析

2.1 不同青稞品种对7.5%啶磺草胺的耐药性测定

耐药性测定结果见表1。由表1可知，北青8号、北青4号、北青6号、昆仑14号、北青3号、柴青1号、北青1号、昆仑15号、北青5号、北青2号的IC50值依次为22.376、20.379、17.516、13.573、12.323、10.374、9.526、7.731、7.197、5.504 g/hm2，其中北青8号耐药性最强，北青2号最为敏感。以IC50值最低的北青2号为敏感性品种，各青稞品种的耐药性倍数依次为4.065、3.703、3.182、2.466、2.239、1.885、1.731、1.405、1.402、1.000。因此，选择耐药性最强的北青8号和耐药性最弱的北青2号，进一步测定施用不同浓度7.5%啶磺草胺后，两个青稞品种体内ALS和GSTs活力差异。

表1 不同青稞品种对啶磺草胺的耐药性差异

2.2 7.5%啶磺草胺对两个青稞品种ALS活力的影响

未施药的两个青稞品种ALS活力变化见图1。同一时间下未施药的北青8号与北青2号的ALS活力没有表现出明显差异，并且随着时间变化，两个青稞品种的ALS活力变化不明显，为2.356～2.721 nmol/(h·mg)。不同浓度7.5%啶磺草胺对两个青稞品种ALS相对活力影响如图2所示。施药后两个青稞品种ALS相对活力均受到明显抑制，施药后第1天受抑制最显著(ALS相对活力最低)，随后逐渐恢复至对照水平。7.5%啶磺草胺浓度为12.5 g/hm2时，北青8号的ALS相对活力在第5天恢复至1.160，北青2号在第7天恢复至1.000。当7.5%啶磺草胺浓度为37.5 g/hm2时，北青8号的ALS相对活力在第7天恢复至0.968，而北青2号ALS相对活力最高仅恢复为0.763。说明不同青稞品种间耐药性差异产生的原因与不同青稞品种ALS对7.5%啶磺草胺敏感性强弱有关，在青稞田间施用7.5%啶磺草胺时浓度的安全剂量为12.5 g/hm2。

图1 未施药处理两个青稞品种ALS活力Fig.1 ALS activity of two varieties of Hordeum vulgare var nudumwithout applying drugs

图2 不同浓度7.5%啶磺草胺对两个青稞品种ALS相对活力的影响Fig.2 Effects of different concentrations of 7.5% pyroxsulam on ALS relative activity of two Hordeum vulgare var nudum varieties

2.3 7.5%啶磺草胺对两个青稞品种GSTs活力的影响

未施药两个青稞品种的GSTs活力见图3。两个青稞品种的GSTs活力变化均不明显，且二者的GSTs活力差异不显著。不同浓度7.5%啶磺草胺对两个青稞品种GSTs相对活力影响如图4所示。两个青稞品种在不同浓度除草剂处理后，GSTs相对活力均有明显变化且反应迅速。在12.5 g/hm2和37.5 g/hm2浓度除草剂处理后第1天，北青2号GSTs相对活力分别为1.402和1.249，北青8号GSTs相对活力分别为1.278和1.218，施药后第3天，两个青稞品种的GSTs相对活力均达到峰值，之后开始下降，第9天基本恢复至对照水平。在两个浓度7.5%啶磺草胺作用下，施药后第3天，北青8号的GSTs相对活力分别为1.626和1.586，北青2号的GSTs相对活力分别为1.456和1.324。北青8号在两个浓度除草剂作用下GSTs相对活力达到峰值时变化幅度小于北青2号，说明北青8号GSTs相对活力大于北青2号。在不同浓度7.5%啶磺草胺作用下两个青稞品种GSTs活力均表现出一样的变化趋势，但北青8号的峰值变化幅度小于北青2号，整体GSTs相对活力大于北青2号。由此可知，北青8号体内GSTs反应更迅速、解毒能力更强，也说明不同青稞品种对7.5%啶磺草胺产生耐药性差异的原因与不同青稞品种体内GSTs活力有关。

图3 未施药处理两个青稞品种GSTs活力Fig.3 GSTs activity of two varieties of Hordeum vulgare var nudumwithout applying drugs

图4 不同浓度7.5%啶磺草胺对两个青稞品种GSTs相对活力的影响Fig.4 Effects of 7.5% pyroxsulam with different concentrations on GSTs relative activity of twoHordeum vulgare var nudum varieties

3 讨论与结论

青稞作为青藏高原最具地域特色的粮食作物，由于其丰富的营养及较强的抗逆性，成为西藏及青海牧民的主食[13]。本研究明确了青海不同地区的青稞主栽品种对7.5%啶磺草胺的敏感性，不同青稞品种对该除草剂耐药性具有较大差异。在供试的10个青稞主栽品种中，北青2号的耐药性最弱，其耐药性倍数为1；北青8号耐药性最强，其耐药性倍数为4.065。李亚东等[10]的研究也证实不同的小麦品种对啶磺草胺的耐药性具有较大差异。

ALS是支链氨基酸合成通路中的第一个酶，在植物生长过程中扮演重要角色，可合成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸[14]。本研究结果表明，在正常生长条件(未施药)下，北青8号(耐药性)和北青2号(敏感性)品种体内的ALS活力在不同时间段内均无显著差异，这说明正常生长条件下两个青稞品种的ALS表达并不存在差异。在12.5 g/hm2的7.5%啶磺草胺处理下，两个青稞品种的ALS活力均显著下降，但在施药后第5天，北青8号率先恢复到较高水平，而北青2号在施药后第13天才恢复到较高水平，说明北青8号比北青2号能更快应对7.5%啶磺草胺的胁迫;当施用浓度增大到37.5 g/hm2时，尽管两个青稞品种的ALS活力均出现显著下降，但在同一时间北青8号始终高于北青2号，此结果与张建树等[15]研究发现ALS对除草剂的敏感性降低，可能是由于目标植物的ALS对抑制剂产生抗性这一结论相同。当除草剂浓度为37.5 g/hm2时，这两个青稞品种的ALS活力上升幅度一直很小，说明当该药达到这个浓度时，对耐药性青稞品种和敏感性青稞品种都产生了极度损伤。因此在青稞田应用该药推荐剂量不超过12.5 g/hm2，这与李亚东等[10]在小麦田使用啶磺草胺推荐剂量不超过13.5 g/hm2的结果相符。

谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)属于抗氧化酶家族，在植物生长发育及压力应激中起着至关重要的作用[16]。李如男等[17]研究表明，GSTs参与农药在植物体内的II相代谢，将农药变为比母体的水溶性更强的物质，使植物毒性降低。本研究发现，在正常生长条件(未施药)下，两个青稞品种体内的GSTs活力在不同时间段内均无显著差异，说明该酶在不同品种间的表达无差异。在12.5 g/hm27.5%啶磺草胺胁迫下，施药后3 d北青8号的GSTs活力迅速达到峰值，且之后时间段的活力一直高于北青2号，说明在该除草剂的“压力”下，北青8号应对更为迅速。而在该药浓度为37.5 g/hm2条件下，各个时间点北青8号的GSTs活力均高于北青2号，因此推测在 7.5%啶磺草胺胁迫下，耐药性品种体内GSTs的迅速过表达是其产生耐药性的原因之一。Kim等[18]研究表明，转入GSTs基因的烟草过表达后对草丁磷的抗性明显增强，与本文研究结果相符。本研究筛选出了对7.5%啶磺草胺具有耐药性的青稞品种，明确了适宜的施药剂量，探究了抗性产生的原因。