蒙药制剂琪素-25丸质量标准研究*

王玮婷，谭谊萌，朱俊宣，邬国栋，杨 丹，薄彧坤，安 明

(内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古包头 014060)

蒙药制剂琪素-25丸，由栀子、苘麻子、苦参、驴血粉和草决明等二十五味药组成，具有燥“协日乌素”、散瘀的功效，主要用于类风湿、游痛症以及关节炎等[1-2]。为更好地控制该蒙药制剂的质量，确保临床用药安全有效，本研究采用TLC法鉴别制剂中栀子、苘麻子的主要成分，并通过HPLC法测定琪素-25丸中栀子苷的含量，进而达到对蒙药制剂琪素-25丸内在质量的控制，为该制剂的生产和使用的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1仪器 岛津LC-20AT型高效液相色谱仪[岛津企业管理(中国)有限公司]；GenPure UV-TOC/UF 超纯水机(美国赛默飞世尔科技有限公司)；AS10200系列超声波清洗机(220V/50Hz)(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；BSA224S-CW电子天平(万分之一天平)、SQP 型电子天平(十万分之一天平)，均购于赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；TDZ5-WS 多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2试药 对照品栀子苷(AF21020852)、对照药材栀子(AF20102601)、苘麻子(AF21020514)均购于成都埃法生物科技有限公司；琪素-25丸(批号：2007071、2007072)由内蒙古包头市中蒙医院制剂室提供；乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇等其余试剂为分析纯。

1.3薄层色谱(TLC)法定性鉴别

1.3.1栀子TLC鉴别 分别取琪素-25丸5.14 g、阴性样品(缺栀子)4.94 g、栀子药材1.0 g，栀子对照药材1.0 g，各加50 %甲醇10 mL于锥形瓶中，超声40 min，过滤，即得4种所需溶液。精密称定栀子苷对照品适量，加乙醇摇匀即得栀子苷对照品溶液(浓度为4 mg/mL)。照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取琪素-25丸供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，栀子药材溶液、栀子对照药材溶液和栀子苷对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂选用乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)，在层析缸中展开，取出，晾干，之后喷显色剂(10 %硫酸乙醇溶液)显色，加热(110 ℃)至斑点显色清晰。

1.3.2苘麻子TLC鉴别 分别取琪素-25丸3.43 g、缺苘麻子的阴性样品3.23 g、苘麻子药材2.0 g，苘麻子对照药材2.0 g，各加石油醚20 mL，使用索氏提取器加热回流，回流至溶液无色，冷却至室温，弃石油醚，挥干残留溶剂，加入乙醇3 mL，超声30 min，冷却至室温，滤过，滤液浓缩到2 mL，即得4种所需溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂选用三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸(3∶1∶0.5∶0.1)，在层析缸中展开，取出，晾干，之后喷显色剂(10 %硫酸乙醇溶液)显色，加热(110 ℃)至斑点显色清晰。将薄层板置于紫外光灯(365 nm)下观察结果。

1.4高效液相色谱(HPLC)法测定琪素-25丸中栀子苷的含量

1.4.1色谱条件 色谱柱为依利特 Supersil ODS2 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(9∶1∶91)；流速为1.0 mL/min；检测波长238 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL。

1.4.2溶液的制备 (1)栀子苷对照品溶液：精密称定栀子苷对照品15.03 mg，加甲醇至50 mL量瓶中，稀释至刻度，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(2)琪素-25丸供试品溶液：取琪素-25丸粉末约2.57 g，精密称定，加甲醇25 mL，称重，超声20 min，冷却至室温，补重，滤过，取续滤液10 mL，加甲醇，定容至25 mL棕色容量瓶中，摇匀，即得。(3)阴性对照溶液：取阴性样品(除栀子)约4.94 g，精密称定，研细混匀，加甲醇25 mL，称重，超声20 min，冷却至室温，补重，滤过，取续滤液10 mL，加甲醇，定容至25 mL棕色容量瓶中，摇匀，即得。

1.4.3提取效率考察 采用单因素实验对取样量和提取时间对提取效率的影响进行考察。

1.4.4专属性 按照“1.4.1”项下，分别精密吸取“1.4.2”项下配制的3种溶液各20 μL，进样分析。

1.4.5线性关系考察 精密量取“1.4.2(1)”项下对照品溶液0.58 mL、0.69 mL、0.81 mL、0.92 mL、1.04 mL、1.16 mL和1.27 mL，加甲醇，定容到5 mL容量瓶中，摇匀。按照“1.4.1”项下进样分析，记录峰面积，进行回归分析。

1.4.6精密度试验 取“1.4.2(1)”项下对照品溶液，按照“1.4.1”项下，连续进样6针进行分析。

1.4.7稳定性试验 取批号为2007071制备的同一份供试品溶液，分别在室温下，放置一定时间(0 h、4 h、8 h、12 h、24 h)，按照“1.4.1”项下进行分析。

1.4.8重复性试验 取同一批号(2007071 )样品,每份约2.57 g(共6份)，按照“1.4.2(2)”项下制备，并按照“1.4.1”项下进行分析。

1.4.9加样回收率试验 (1)栀子苷对照品溶液的制备：精密称定栀子苷对照品21.36 mg，加甲醇至50 mL量瓶中，稀释至刻度，即得。(2)供试品溶液的制备：取同一批号(2007071 )样品9份，每份约1.29 g，分为3组，每组依次加入50 %、100 %、150%供试品含量的栀子苷对照品溶液(对应体积为2 mL、4 mL和6 mL)，按照“1.4.2(2)”项下制备，并按照“1.4.1”项下进行分析。

1.4.10耐用性试验 取批号为2007071的供试品约2.57 g，精密称定，按照“1.4.2(2)”项下制备，并更换其他厂家色谱柱，按照“1.4.1”项下进行分析。

2 结果

2.1TLC法定性鉴别结果

2.1.1栀子TLC鉴别 与对照品、对照药材色谱相比，供试品溶液在对应位置上显示相同颜色的清晰斑点，阴性对照溶液无干扰。见图1。

图1 琪素-25丸中栀子的TLC图谱

2.1.2苘麻子TLC鉴别 与苘麻子对照药材色谱相比，供试品溶液在对应位置上显示相同颜色的清晰荧光斑点，阴性对照溶液无干扰。见图2。

图2 琪素-25丸中苘麻子的TLC图谱

2.2琪素-25丸中栀子苷含量测定结果

2.2.1提取效率考察 (1)取样量的考察：取样量为2.57 g时，栀子苷含量最高，故取样量定为2.57 g。(2)提取时间的考察：提取时间为20 min时，栀子苷含量最高，故提取时间定为20 min。见表1和表2。

表1 取样量考察测定结果

表2 提取时间考察测定结果

2.2.2专属性 在供试品色谱中，栀子苷分离度大于1.5；在阴性对照溶液色谱图中，栀子苷处未有吸收，说明其它组分对琪素-25丸中栀子苷的测定没有干扰，专属性好。见图3～图5。

图3 栀子苷对照品溶液色谱图

图4 供试品溶液色谱图

图5 阴性对照溶液色谱图

2.2.3线性关系考察 栀子苷峰面积在34.73～76.40 μg/mL范围内呈线性，回归方程为y=30762x-92915(R2=0.9991)。见表3。

表3 栀子苷的标准曲线数值表

2.2.4精密度试验 经6次测定，栀子苷对照品峰面积RSD为1.2 %(n=6)，表明该仪器精密度良好。见表4。

表4 精密度峰面积

2.2.5稳定性试验 不同放置时间测定样品中栀子苷的平均峰面积RSD为2.0 %，表明琪素-25丸中栀子苷放置24 h后稳定性良好。见表5。

表5 不同时间测定样品中栀子苷的峰面积

2.2.6重复性试验 栀子苷平均含量为0.134 %，RSD为1.7 %，表明样品重现性良好。见表6。

表6 栀子苷重现性试验结果

2.2.7加样回收率试验 样品中栀子苷的平均回收率为104.7 %，RSD为1.7 %。见表7。

表7 加样回收率测定结果

2.2.8耐用性试验 使用三根不同厂家、不同型号的柱子进行分析，样品中栀子苷的平均含量为0.129 %，RSD为1.2 %。见表8。

表8 不同色谱柱的耐用试验

2.2.9样品及药材含量测定 取两批(批号：2007071、2007072)琪素-25样品、模拟样各2份，每份约2.57 g，精密称定；取两批栀子药材(批号：1909002、1909003)，各2份，每份约0.1 g，精密称定，按照“1.4.2(2)”项下制备，并按照“1.4.1”项下进行分析。经测定，两批样品及模拟样中栀子苷平均含量分别为0.135 %、0.136 %、0.146 %和0.146 %；药材中栀子苷平均含量分别为4.50 %和4.60 %。见表9和表10。

表9 样品含量测定结果

表10 栀子药材中栀子苷含量测定结果

结合表9和表10计算本品含量限值。按理论值折算，模拟样品应含栀子苷0.177 %，转移率=[(0.146+0.146)/2]/0.177×100 %=82.49 %。《中国药典》2020年版[3]一部“栀子”项下规定：含栀子苷不得少于1.8 %。含量低限=20/514×1.8 %×82.49×0.01=0.0578 %。考虑到药材之间质量差异的影响，下浮10 %，暂定本品含栀子苷(C17H24O10)不得少于0.0520 %。

3 讨论

3.1鉴别及定量分析中目标成分的选择 琪素-25丸制剂中驴血粉为君药，苘麻子为臣药，栀子为佐药。驴血粉属于动物药，其质量难以控制，故选取臣药和佐药进行研究。苘麻子具有清热解毒、利湿和退翳的功效。栀子具有清热、泻火和凉血的功效，其中栀子苷具有较强的抗炎镇痛作用[4]。因《中国药典》2020年版[3]一部中无苘麻子含量测定参照方法，所以，选择对苘麻子和栀子进行薄层鉴别，对栀子中栀子苷进行含量测定。

3.2检测波长的选择 采用二极管阵列检测器对琪素-25丸中栀子苷在200～400 nm范围内扫描，栀子苷在240 nm处有最大吸收。参照《中国药典》2020年版[3]及文献[5]，故选择238 nm作为实验的检测波长。

3.3提取方法及取样量的选择 参照《中国药典》2020年版[3]一部“栀子”项下，选择甲醇作为提取溶剂，提取方式采用超声提取技术。从节约能源、提高提取效率方面考虑[6]，本实验考察了取样量(2.37 g、2.57 g和2.77 g)和提取时间(10 min、20 min和30 min)对栀子苷提取效率的影响。结果表明，取样量为2.57 g，最佳提取时间为20 min。

3.4流动相的选择 《中国药典》2020年版[3]一部中采用乙腈-水(15∶85)为流动相对栀子苷进行含量测定，在此条件下，琪素-25丸中栀子苷峰与其他杂峰分离效果不好。查阅文献[7-10]，调整流动相，尝试乙腈-水(13∶87)和乙腈-水(10∶90)等发现分离度效果不理想，在乙腈-水(9∶91)时，栀子苷分离效果理想，保持良好峰形，因此，最终选择乙腈-水(9∶91)作为本研究的流动相。

综上所述，本研究建立了蒙药制剂琪素-25丸中栀子和苘麻子TLC定性鉴别方法，与对照品或对照药材色谱相比，样品溶液在对应位置上显示相同颜色的、独特的清晰斑点或荧光斑点，且阴性溶液对样品无影响，专属性强。同时，使用HPLC法建立了琪素-25丸中栀子苷的含量测定方法，该方法简单，稳定，栀子苷峰面积在34.73～76.40 μg/mL范围内呈线性，且重现性好。本研究建立的蒙药制剂琪素-25丸TLC定性鉴别和HPLC含量测定的方法可用于建立蒙药制剂琪素-25丸的质量标准，并为蒙药制剂琪素-25丸质量控制提供依据。