黄姑鱼NK-lysin基因的克隆及表达分析

吴宝兰，罗 帅，韩 芳，王志勇

(1.集美大学水产学院，福建 厦门 361021；2.农业农村部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021)

0 引言

NK-lysin是一种由细胞毒性T细胞(cytotoxicT-lymphocytes,CLT)和自然杀伤淋巴细胞(naturalkillerlymphocytes,NKL)分泌的抗菌肽，属于鞘脂激活蛋白样蛋白(saposin-like protein)家族[1]。越来越多的鱼类NK-lysin被研究，如：王改玲等[2]通过原核表达纯化出了草鱼(Ctenopharyngodonidella)的NK-lysin可溶性融合蛋白，并证明了该重组蛋白对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有抑菌活性；许巧情等[3]在真核毕赤酵母体系中表达了黄鳝(Monopterusalbus)的NK-lysin蛋白，并表明对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和维氏气单胞菌(Aeromonasvertebrosa)具有明显抑制作用；半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)的NK-lysin蛋白具有调节免疫、抑制细菌和病毒增长的功能[4];人工合成的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)NK-lysin蛋白具有较强的抗寄生虫活性[5]。大量研究证明，NK-lysin具有较强的杀菌[6]、抗病毒[7]和抗寄生虫作用[8]，在鱼类抵抗病原体感染的先天免疫反应中发挥重要作用。

黄姑鱼(Nibeaalbiflora)是一种重要的海水经济鱼类，主要分布于我国沿海[9]。由弧菌引起的黄姑鱼细菌性疾病日趋严重，其病原菌主要包括哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)[10]、创伤弧菌(Vibriovulnificus)[11]和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)[12]等。长期以来主要使用抗生素预防和治疗鱼类疾病，导致药物残留和耐药性细菌滋生等问题越来越严重。NK-lysin等抗菌肽具有分子量小、抗菌谱广和不易产生耐药性等优点，可作为一种新型高效的抗菌药物。研究NK-lysin等抗菌肽有助于探明鱼类的免疫功能，对开发新型抗生素具有重要意义[13]。到目前为止，尚未有关于黄姑鱼抗菌肽基因的研究报道。本研究尝试从黄姑鱼中克隆NK-lysin基因，分析其分子结构特征和系统进化树，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术进一步检测和分析该基因在健康组织和哈维氏弧菌感染后的不同组织的表达情况，同时分析YdNkl-2蛋白的亚细胞定位，为更进一步研究YdNkl-2的功能及开发黄姑鱼NK-lysin等抗菌肽药物奠定基础，并为开辟黄姑鱼病害预防新途径提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 实验材料

实验所用黄姑鱼幼鱼((3.28±1.71)g)购自福建省宁德市金铃水产科技有限公司。攻毒前，所有鱼在充气海水中驯养两周，水温(27.1±2.1)℃，盐度30，水深1.0 m。每天在固定时间(每天早上7:00和下午6:00)饲喂两次市售的黄姑鱼配合饲料(天马水产科技有限公司)。人工攻毒实验所用的哈维氏弧菌菌株分离于自然发病鱼，由孙云章教授惠赠。

从暂养群体中采集用于黄姑鱼组织表达分析的组织(脑、心脏、鳔、肾脏、肝脏、皮肤、鳃、胃、头肾、脾脏、小肠和肌肉)。哈维氏弧菌感染实验采用浸泡感染的方法进行：在一个面积为4 m2，深度为1.5 m的混凝土水池中，将8 L细菌悬浮液(109CFU/mL)均匀泼洒在水中，使其与鱼充分接触，细菌感染过程持续3 h，之后，将所有鱼转移到装有新曝气海水的池子中，用次氯酸钠对原来的池子进行消毒。分别在哈维氏弧菌感染黄姑鱼后6，12，24，48，72，96 h采集头肾、肝脏和脾脏，置于RNA保护液中，随后保存在-80 ℃的冰箱中。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒(TransZolUp Plus RNA Kit)购自北京全式金生物技术有限公司；逆转录试剂盒(GoScriptTMReverse Transcription System Protocol，Promega)购自上海泰京生物技术有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和无内毒素质粒小量提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司；一步克隆试剂盒(ClonExpress©II One Step Cloning Kit)和荧光定量染料(ChamQTMUniversal SYBR©qPCR Master Mix)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Lipo8000TM转染试剂、GFP Rabbit Monoclonal Antibody、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、蓝色荧光染料(DAPI)、BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准(15～120 ku)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、BeyoBlueTM考马斯亮蓝快速染色液和BeyoECL Plus化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(Beyotime)；胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品；PBS(pH=7.4)缓冲液、胰蛋白酶消化液Trypsin EDTA Solution A(0.25%胰酶和0.02% EDTA)和DMEM High Glucose均为BI公司产品；双抗(Penicillin 10000 IU/mL-Streptomycin 10 mg/mL)为MP公司产品。本研究所用引物均在厦门铂瑞生物科技有限公司合成。

1.3 RNA提取及cDNA的合成

使用TransZolUp Plus RNA Kit进行组织样品的RNA提取，用逆转录试剂盒合成cDNA的第一条链，并用内参基因β-actin对cDNA合成质量进行检测。

1.4 YdNkl-2开放阅读框序列的克隆和载体构建

从本实验室构建的黄姑鱼转录组数据库中获得YdNkl-2的开放阅读框序列。根据ClonExpress©Ⅱ一步克隆试剂盒设计了具有EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制性位点的特异性引物(见表1)。PCR的步骤如下：95 ℃，3 min预变性，进行30个扩增循环(95 ℃变性15 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃彻底延伸5 min。将纯化后的YdNkl-2产物连接到pEGFP-N1(本实验室保存)，送往铂瑞生物技术有限公司测序。

表1 本研究所用引物

1.5 生物信息学分析

通过ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的理化性质，包括分子量、理论等电点和氨基酸组成；通过SignaIP program(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽；通过http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/预测蛋白磷酸化；通过NetGlycate在线工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGlycate/)进行蛋白质的糖基化位点分析；通过http://www.detaibio.com/sms2/color_align_prop.html和Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行氨基酸序列多重比对；通过http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1预测蛋白质的结构域；通过http://swissmodel.expasy.org/interactive预测蛋白质的三级结构，并用VMD 1.9.2 beta 1编辑蛋白质三级结构；利用MEGA 6.06软件的Maximum-Likelihood法进行系统进化树分析。

1.6 实时荧光定量PCR分析YdNkl-2 mRNA的表达

设计了特异性引物qYdNkl-2-F和qYdNkl-2-R(见表1)，选择黄姑鱼β-actin作为内参基因，以稀释80倍的cDNA为模板进行荧光定量PCR。用StepOnePlus荧光定量PCR仪，按照荧光定量染料ChamQTMUniversal SYBR©qPCR Master Mix说明书进行PCR。PCR反应体系(20 μL)：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL；正向、反向引物各0.5 μL；cDNA模板 4 μL；无菌水 5.0 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；循环40次。最后熔解曲线步骤：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每个样品进行3个生物学重复，4个技术重复。采用2-ΔΔCt法结合SPSS 20.0中的one-way ANOVA及LSD Multiple Comparison Test进行基因差异表达分析，P<0.05表示差异显著。

1.7 YdNkl-2的亚细胞定位

将构建成功的表达质粒GFP-YdNkl-2转染至人类胚胎肾293T(HEK 293T)细胞进行亚细胞定位。把HEK 293T细胞接种到12孔板中，培养基含有10%(体积分数) FBS和1%(体积分数)双抗的DMEM，维持5%(体积分数) CO237 ℃恒温培养24 h，之后，使用Lipo 8000TM转染试剂分别将 GFP-YdNkl-2和pEGFP-N1质粒(对照组)转染到细胞中。

在转染24 h后，收集细胞并用细胞裂解缓冲液裂解，然后通过Western blot验证GFP-YdNkl-2和pEGFP-N1蛋白。蛋白质印迹步骤如下：蛋白质样品通过12%(质量分数)SDS-PAGE处理后转移到PVDF膜上；将膜用含有5%(质量分数)牛血清白蛋白的TBST缓冲液在室温下封闭孵育2 h，然后转移到GFP一抗稀释液中4 ℃过夜；用TBST洗涤5次(每次5 min)，将膜与二抗稀释液一起孵育2 h，再用TBST洗涤7次(每次5 min)。膜用BeyoECL Plus化学发光试剂盒检测，用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)拍照。

另外，用4%(质量分数)多聚甲醛固定细胞，0.2%(体积分数)Triton X-100透化细胞，0.2%(体积分数)DAPI染色。使用共焦荧光显微镜Leica TCS SP8系统(Leica，德国)观察蛋白质的亚细胞定位。

2 结果与分析

2.1 YdNkl-2基因序列分析

根据本实验室组装的黄姑鱼基因组数据(未发表)，YdNkl-2基因cDNA全长为600 bp，包括6 bp的5′非编码区(UTR)、138 bp的3′非编码区(UTR)和456 bp的开放阅读框(ORF)，编码151个氨基酸(见图1)。该蛋白质的理论相对分子质量为17.04 ku，理论pI为5.21。采用SignaIP 5.0 Server预测YdNkl-2，发现包含一个信号肽。SMART蛋白结构域的预测表明，YdNkl-2蛋白具有一个鞘脂激活蛋白B(saposin B)结构域(见图2)。通过SWISS-MODEL数据库建模，YdNkl-2蛋白的三级结构如图3所示，主要由多个α-螺旋组成。

2.2 YdNkl-2氨基酸同源性和系统进化关系分析

氨基酸同源性比较结果表明：黄姑鱼与鱼类的同源性为30.46%～81.46%(见表2)，具有较高的同源性；与其他物种一样，含有6个保守的半胱氨酸(cysteine，C)(见图4)。

系统进化分析表明：YdNkl-2蛋白与鱼类的NK-lysins聚为一支(见图5)；哺乳动物和鸟类各自聚为一支。结构相似性和保守进化关系表明：YdNkl-2蛋白是鞘脂激活蛋白样蛋白家族的成员，并包含NK-lysin的基本特征。

表 2 YdNkl-2蛋白系统发育分析的序列登录号

2.3 YdNkl-2的组织表达图谱及哈维氏弧菌感染后的表达变化

用qRT-PCR检测YdNkl-2在健康组织中的表达情况，结果如图6所示，YdNkl-2的mRNA普遍分布于各个组织，但不同组织/器官中的表达量存在差异，在鳃和脾脏中的表达量较高，而在脑和肌肉中的表达量较少。

哈维氏弧菌浸泡感染黄姑鱼后，YdNkl-2在头肾、肝脏和脾脏中的表达如图7所示。头肾、肝脏和脾脏中YdNkl-2的表达量均明显升高。其中：肝脏中，YdNkl-2的mRNA表达量在24 h显著上升并达到峰值；脾脏中，YdNkl-2的mRNA表达量在6 h显著上升并达到峰值；头肾中，YdNkl-2的mRNA表达量在12 h显著上升并达到峰值。这些结果暗示YdNkl-2具有潜在的免疫功能。

2.4 YdNkl-2的亚细胞定位

YdNkl-2蛋白的亚细胞定位结果(见图8)显示，GFP-YdNkl-2蛋白在HEK 293T细胞中成功表达，与实际大小一致(43 ku)；GFP-YdNkl-2蛋白在细胞质和细胞核都有分布，与pEGFP-N1结果相似。

3 讨论

NK-lysin的氨基酸序列具有多态性[14]，YdNkl-2与其他鱼类的NK-lysin有较高的同源性(30.46%～81.46%，见表2)，而与哺乳类和鸟类的同源性只有12.57%～21.56%；不过，YdNkl-2在进化过程中还是具有高度保守的结构，含有一个鞘脂激活蛋白B(saposin B)结构域和6个保守的半胱氨酸(cysteine，C)。有研究证明NK-lysin的鞘脂激活蛋白B(saposin B)结构域与鞘脂的降解代谢有关[15]；6个保守的半胱氨酸可形成3个分子内二硫键，而二硫键是NK-lysin发挥抗菌活性的关键[16]；YdNkl-2与大多数鱼类[17-18]、哺乳类NK-lysin基因的结构相似，由5个外显子和4个内含子组成。综上，YdNkl-2具有保守的结构特征，与其生物学功能密切相关。

黄姑鱼鳃和脾脏中的YdNkl-2表达量较高，脑和肌肉中的较少。其他鱼类也有类似的研究结果，例如：虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的NK-lysin蛋白在鳃和脾脏中高表达[19]；团头鲂(Megalobramaamblycephala)[20]和大黄鱼(Larimichthyscrocea)[21]的NK-lysin蛋白在鳃和脾脏中高表达，在肌肉中表达量极低。鳃是鱼类抵御病原体的第一道防线，同时脾脏是鱼类的主要免疫器官，这些结果提示YdNkl-2在黄姑鱼抵御病原体中发挥着重要作用。

哈维氏弧菌浸泡感染黄姑鱼后，黄姑鱼YdNkl-2在头肾、肝脏和脾脏中的YdNkl-2表达量均明显升高。在其他鱼类的研究中，用lipopolysaccharide(LPS)刺激黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，头肾中NK-lysin的表达量显著上升并在12 h达到峰值[17]；卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)被美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)感染后，肝脏和脾脏中的NK-lysin表达量均显著上升[6]；大黄鱼被刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)刺激后，头肾、肝脏和脾脏中的NK-lysin表达量均明显升高[22]。这些结果表明，对于不同的免疫刺激，NK-lysin在头肾、肝脏和脾脏等免疫器官中的表达量均显著上升，提示NK-lysin在鱼类中参与重要的免疫功能。

通过PSORT在线工具(https://www.genscript.com/psort.html)预测YdNkl-2蛋白的亚细胞定位，结果显示在细胞质(21.7%)、细胞核(13.0%)、细胞外(17.4%)均有分布；通过构建真核表达质粒GFP-YdNkl-2进行亚细胞定位验证，与在线预测结果一致，GFP-YdNkl-2蛋白在细胞质和细胞核均有分布。NK-lysin含有一个信号肽，为分泌型蛋白，在病原体的刺激下，会被释放到细胞外，主要通过破坏病原体的细胞膜来发挥抗菌功能[17,23-24]。

鱼类抗菌肽是鱼类先天免疫系统中的一类效应分子，作为抵御微生物病原体入侵的第一道防线，具有抗菌活性高、抗菌谱广等优点，是一种极具应用前景的抗生素的替代品。直接从生物体分离纯化抗菌肽成本太高，且数量极少，而人工合成的抗菌肽较长时，又存在纯化困难和成本高等一系列问题。采用分子克隆和基因工程技术体外表达抗菌肽，在新型鱼病抗菌药物开发领域显示出巨大的潜力。2015年我国审批通过第一个海洋动物(大黄鱼)抗菌肽基因工程产品生产应用安全证书，2016年青蟹抗菌肽基因工程产品生产应用安全证书也获批。

研究[25]表明，将重组天蚕素抗菌肽B和天蚕素抗菌肽P1单细胞克隆入鲑鱼(Chinooksalmon)胚胎细胞中，鲑鱼胚胎细胞表达出来的天蚕素抗菌肽对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和安圭拉弧菌(Vibrioanguillarum)等3种病原菌有很强的抑制作用。在水生动物饲料中，将抗菌肽制剂添加到鱼饲料中，不仅可以提高水产动物的免疫抗病力，而且可以提高水产品质量，缓解水产养殖中的细菌耐药性及水产品抗生素污染等问题。林鑫等[26]将饲喂添加抗菌肽饲料的锦鲤感染维氏气单胞菌10 d后的累积死亡率显著降低，证实口服抗菌肽可以显著提高锦鲤的抗病能力。本实验首次从黄姑鱼中克隆到含151个氨基酸的抗菌肽，分子量小，结构简单，具有保守的结构特征；经哈维氏弧菌刺激后，可诱导YdNkl-2在黄姑鱼免疫器官中显著上调表达，为进一步研究其抗菌机制奠定了基础；同时通过酵母发酵和喷雾干燥工艺制成酵母制剂，可获得安全高效的饲料添加剂，也可作为饲料原料或者食品的防霉抑菌剂，能有效解决海水养殖中的抗生素污染和饲料原料易霉变等问题，还可以研制成新型药物，为我国水产养殖业提供能够替代抗生素的安全有效的抗菌药物。