Lnc RNA CUDR敲低对肝癌侵袭、增殖和凋亡的影响

王 波，金 雯*，周健坤，陈 良，曹立宇

（1.铜陵职业技术学院医学护理系，安徽铜陵 244061；2.合肥市第二人民医院高压氧科；3.安徽医科大学第一附属医院病理科）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）已成为全球第六大常见恶性肿瘤，且致死率居癌症中第三位[1]。早期转移与高复发是影响HCC患者预后的关键。研究显示，长链非编码RNA（long chain non-coding RNA，Lnc RNA）在HCC的发生、发展中起重要作用，其可与一些信号因子互相作用，发挥调节细胞周期、调控信号转导、干扰肿瘤耐药及影响肿瘤微血管生成等作用[2,3]。LncRNA CUDR是长链非编码RNA家族的成员之一，有研究表明，CUDR可通过激活AKT/ERK通路增强胰腺癌的恶性表型[4]，而其在参与肝癌进展中的详细作用尚不明确。本研究旨在观察并探讨LncRNA CUDR表达下调对HCC侵袭、增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

SMMC-7721细胞（美国ATCC细胞库）；CUDR shRNA慢病毒质粒（上海吉玛公司）；DMEM（美国Gibco公司）；RPMI 1640和PBS，pH7.4（美国Gibco公司）；胎牛血清（Bio IND，04-002-1A）、Antibiotic-Antimycotic、Trypsin-EDTA（0.05%）和Lipofectamine 2000转染试剂（美国Lifetechnologies公司）；TRIzol试剂及qPCR试剂盒（上海Beyotime公司）等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 SMMC-7721细胞于37℃、5%CO2培养箱10%胎牛血清中培养，相对湿度90%；37℃条件下用0.25%胰蛋白酶消化、清洗，加入DMEM/RPMI 1640完全培养基5ml，反复吹打，制成细胞悬液，接种于25ml培养瓶中，1：2分瓶传代培养，于对数期接种于6孔板中；至细胞达到80%～90%融合时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书滴入CUDR shRNA慢病毒转染每孔细胞，48h后收集细胞；实验设CUDR敲低组、对照组、空质粒组，采用RT-PCR方法检测CUDR敲除效率，2-ΔΔCt法计算CUDR mRNA相对表达量。

1.2.2 RT-PCR检测CUDR mRNA的表达 按TRIzol试剂说明步骤，将细胞悬液滴入600μl Buffer RL，裂解、离心后，收集mRNA溶液；分光光度计定量测定总量；按照qPCR试剂盒说明配置反应体系行逆转录，RT-PCR检测CUDR mRNA相对表达量，引物序列设计为，CUDR-F：ACGCTAACTGGCACCTTGTT；CUDR-R:CTCCGGACTGCTTCAAGTGT；GAPDHF:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；GAPDH-R：AGGGCCATCCACAGTCTTC。

1.2.3 Transwell检测肝癌细胞侵袭力 接种前用PBS清洗24孔板和Transwell小室，室中铺80µl matrigel胶，37℃培养箱中放置30min；用0.25%胰蛋白酶消化细胞后，使用无血清DMEM培养基重悬细胞至密度达1×105个/mL，分别吸取0.2ml细胞悬液接种到Transwell小室内，下层加入0.8ml含10%胎牛血清的DMEM完全培养液，置于37℃培养箱中培养过夜；每孔加入1ml 4%多聚甲醛溶液，室温固定15min；吸去固定液，采用PBS清洗2次，每孔加入0.5%结晶紫溶液1ml，染色60min，PBS清洗、晾干；于100×显微镜下观察并计数下室细胞数。

1.2.4 瘤球成形实验检测肝癌细胞聚集、增殖能力 0.25%胰蛋白酶消化细胞后离心，用PBS清洗干净；细胞重悬于DMEM/F12培养基中；采用超低吸附细胞培养板，每孔植入500～5000个细胞，每3～4d补加培养基；10d后完成培养，观察细胞成球状态并拍照计数，计数标准：瘤球长径≥30µm。

1.2.5 流式技术检测细胞凋亡率 按试剂盒说明书步骤，测定细胞凋亡率。1000rpm离心各组细胞5min；当细胞密度达1×106/mL，取100μl细胞悬液，分别加入AnnexinVFITC结合物和PI solution 各5μl；室温孵育15min；加入400μl 1×Annexin V Binding Solution后，上流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析实验结果，计量资料采用均数±标准差表示，行方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CUDR shRNA转染效率

3组CUDR mRNA相对表达量分别为：CUDR敲低组3.230±0.339；对照组8.934±0.625；空质粒组9.373±0.770；CUDR敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义（F=96.215，P＜0.001）；对照组与空质粒组比较无差异（P=0.408），见图1。

图1 CUDR shRNA慢病毒质粒转染效率

2.2 Transwell侵袭检测结果

3组穿透下室细胞数分别为：CUDR敲低组（49.333±4.412）个；对照组（132.500±4.930）个；空质粒组（139.167±6.853）个。CUDR敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义（F=496.989，P＜0.001）；对照组与空质粒组比较无差异（P=0.053），见图2。

图2 敲低CUDR对SMMC-7721肝癌细胞侵袭的影响

2.3 肝癌瘤球成形实验结果

3组瘤球成形数分别为：CUDR敲低组（8.333±1.470）个；对照组（33.500±4.930）个；空质粒组（30.333±2.658）个。CUDR敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义（F=96.685，P＜0.001）；对照组与空质粒组比较无差异（P=0.122），见图3。

图3 敲低CUDR对SMMC-7721肝癌细胞聚集、增殖的影响

2.4 流式技术检测细胞凋亡率结果

3组细胞凋亡率分别为：CUDR敲低组（9.907±0.732）%；对照组（4.807±0.451）%；空质粒组（4.620±0.682）%。CUDR敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义（F=67.259，P＜0.001）；对照组与空质粒组比较无差异（P=0.731），见图4。

图4 敲低CUDR对SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响

3 讨论

手术切除是治疗HCC最为有效的方法之一，但由于HCC微转移发生早，高复发仍然是导致术后低生存率的关键。鉴于我国HCC患者初诊时多已处于中晚期，其术后中位生存期仅为2年左右[5]。持续的细胞恶性增殖是HCC发生、发展的重要生物学特征，抑制恶性增殖是肿瘤治疗的核心原则之一[6]。HCC的发生、发展是由多基因突变并涉及诸多信号转导通路的复杂生物学过程[7]。因此，探究HCC发生、发展的生物学机制可以为治疗HCC提供基础理论支撑。

LncRNAs异常表达与HCC进展关系密切，被认为是HCC诊疗的潜在靶点。LncRNA MALAT1可与miR-140靶向结合促进肝癌细胞的血管生成和免疫抑制[8]。Lnc RNA FOXD2-AS1可通过调节miR-206/MAP3K1信号轴促进肝细胞癌的发生、发展进程[9]。下调LncRNA MALAT1可能通过影响PI3K/Akt信号传导通路上关键靶点抑制肝癌细胞的增殖，迁移及体外成瘤能力[10]。上述表明，LncRNAs可在多条信号通路中扮演癌基因的角色，进一步明确LncRNAs的功能有助于深入认识HCC的复发和转移机制。LncRNA CUDR具有调节细胞分化和多能性的功能[11]。本研究采用CUDR shRNA慢病毒质粒转染SMMC-7721细胞并构建CUDR稳定表达的肝癌细胞系，RT-PCR检测显示，CUDR基因敲低组CUDR mRNA表达量与对照组和空质粒组比较显著下调，差异有统计学意义（P＜0.001）。为探究CUDR在HCC中的作用意义，分别行Transwell侵袭实验和肝癌瘤球成形实验检测肝癌细胞的侵袭、聚集和增殖能力，结果显示CUDR敲低后肝癌细胞侵袭力、聚集和增殖能力与对照组和空质粒组相比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001）；流式技术检测细胞凋亡率结果显示CUDR敲低后肝癌细胞的凋亡率与对照组和空质粒组相比显著提高，差异有统计学意义（P＜0.001）。上述提示，调低CUDR基因可以抑制HCC的侵袭和增殖并促进癌细胞的凋亡。研究显示，LncRNA CUDR可与P53（N340Q/L344R）形成复合物，该复合物进一步与PKM2的启动子区域结合，增强PKM2的表达、磷酸化以及激活系列级联反应进而促进HCC的进展[12]。LncRNA CUDR可与炎症细胞因子IL6相互作用，使MELLT3与SUV39h1 mRNA3'UTR结合，促进SUV39h1的表达，进而增强组蛋白H3对第九赖氨酸（H3K9me3）的甲基化，增强肝癌干细胞的恶性表型[13]。上述内容进一步说明LncRNA CUDR在HCC发生、发展中起致癌基因作用，调低CUDR可抑制HCC的进展，其可能成为HCC治疗的潜在靶点。

综上，LncRNA CUDR在HCC进展中发挥致癌基因的作用。本研究发现，敲低CUDR后可以抑制HCC的侵袭和增殖并促进癌细胞的凋亡，为HCC的靶向治疗提供理论依据。