柴胡-白芍药对治疗肝纤维化作用机制网络药理学研究※

阎思宁 李奇洪 卢朝睿 郭峻峰 李紫钰 赵泽玮 王佳艺 王宝家

(1.成都中医药大学2018级本科生，四川 成都 610036；2.成都中医药大学2019级本科生，四川 成都 610036；3.成都中医药大学基础医学院温病教研室，四川 成都 610036)

肝纤维化是指由多种致病因素所致肝细胞外纤维组织异常增生的病理变化过程，在国际疾病分类(ICD-10)中亦可作为一种病名(K74.001)[1]。肝纤维化是慢性肝病的重要结局，持续发展又可导致肝硬化、肝衰竭，甚至发展为肝细胞癌[2]。慢性肝病是影响人们健康的主要疾病之一，全世界每年约有200万人死于肝病，占全球死亡人数的3.5%，其中约100万人死于肝硬化并发症，约100万人死于病毒性肝炎和肝细胞癌[3-4]。因此，阻止肝纤维化的发展或逆转肝纤维化过程是防治慢性肝病进一步发展、降低病死率的关键[5-6]。根据肝纤维化患者的临床症状表现，可以将其归属于中医学黄疸、胁痛、鼓胀、肝积等肝系疾病范畴。现代研究表明，四逆散[7-8]、小柴胡汤[9-11]、小柴胡汤合当归芍药散[12]、血府逐瘀汤[13]、柴胡疏肝散[14]等经方在治疗肝纤维化方面效果显著。我们通过综合分析上述方剂，发现柴胡和白芍都是方中的重要药物，也是治疗肝系疾病的常用配伍药对[15-16]。柴胡味辛、苦，性微寒，入肝、胆、肺经，能引药入肝，主疏肝，是重要的引经药，常用于和解表里，升举阳气，《神农本草经》曰其“主心腹肠胃中结气”。白芍味苦、酸，性微寒，入肝、脾经，具有养血柔肝、调经止痛的功效，《神农本草经》曰其能“除血痹，破坚积，治寒热疝瘕”。柴胡和白芍两者合用，可疏肝柔肝，升阳益木，既可以消散长期滞留于肝的癥瘕，又能滋养正邪抗争所消耗的肝血。现代多项研究表明柴胡、白芍配伍具有解毒、抗炎、保肝等药理作用，且疗效甚佳[17-18]。目前，柴胡和白芍治疗肝纤维化的药理研究多侧重于单药及复方，其研究结果较局限或宽泛，尚未发现能揭示柴胡与白芍配伍治疗肝纤维化作用机制的研究成果。因此，我们拟通过运用网络药理学方法，获取柴胡-白芍药对治疗肝纤维化的主要活性成分及关键靶点，构建可视化网络，分析其治疗肝纤维化的物质基础和作用机制，为临床应用提供参考依据。

1 研究方法

1.1 柴胡-白芍药对活性成分筛选与作用靶点预测 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，分别以“柴胡”和“白芍”为关键词检索柴胡和白芍中的化学成分。参考药物动力学原理，以口服生物利用度(OB)≥30%及类药性(DL)≥0.18为筛选条件，预测柴胡和白芍的活性成分。在TCMSP数据库中检索得到的活性成分，获得其相对应的作用靶点，借助Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org)对靶点的基因名称进行校正。

1.2 肝纤维化疾病相关靶点获取及关键靶点筛选 以“liver fibrosis”为检索词，分别在OMIM数据库(https://www.genecards.org)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中进行检索，将2个数据库中获得的靶点数据取并集，剔除重复值后保留唯一值，获得肝纤维化相关的靶点数据，并利用Uniprot数据库将靶点名称标准化。将柴胡-白芍药对以及肝纤维化的靶点导入Draw Venn Diagram平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)，相互映射后得到药对与疾病的交集靶点，即柴胡-白芍药对治疗肝纤维化的潜在关键靶点。

1.3 “药对-活性成分-关键靶点-肝纤维化”网络构建 在Excel软件中通过VLOOKUP函数将关键靶点与药对活性成分进行精确匹配，制作Network和Type文件，并将其导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析，构建“药对-活性成分-关键靶点-肝纤维化”网络图。在“Tools”中选择“Network Analyzer”进行拓扑分析，得到各个靶点的Degree值，即每个节点的连线数目。筛选出Degree值排名前3的活性成分作为关键成分，节点大小依据Degree值设置，Degree值越大则节点越大。

1.4 “药对-肝纤维化”关键靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)构建 将关键靶点导入String数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行PPI构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，可信度设置为>0.9，获得PPI的tsv文件，并将其导入Cytoscape 3.7.2软件构建关键靶点的PPI可视化网络。用Network Analyzer工具进行拓扑分析，得到各个靶点的Degree值，节点大小和颜色依据Degree值设置，同时筛选出Degree值排名前15的靶点，作为核心靶点[19]。

1.5 关键靶点的基因本体(GO)富集分析与京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析 借助Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)进行GO富集分析与KEGG富集分析。将关键靶点导入Metascape数据库，“Analysis as species”选择“H.sapiens”，提交数据后在“Enrichment”选项卡中依次选择GO生物过程(biological processes,BP)、分子功能(molecular functions,MF)、细胞组成(cellular components,CC)及KEGG通路(KEGG Pathway)进行富集分析，筛选得到同时满足至少含有3个靶点、P≤0.01、富集程度≥0.15条件的数据，并将得到的数据处理后导入微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/login)绘制气泡图。

1.6 关键活性成分与核心靶点的分子对接 选取“药对-活性成分-关键靶点-肝纤维化”网络中得到的3个关键活性成分，从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下载获得其SDF结构，并导入Chem3D 18.0软件进行优化；在Uniprot数据库中搜索PPI网络中排名前5的核心靶点的对应编号，在RCSB PDB数据库(https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/50)中下载其受体结构，并将其导入PyMOL软件，除去这些目标蛋白质的水分子和非活性配体，最后将其导入AutoDockTools 1.5.6软件添加极性氢和电荷，并构建活性口袋，这些活性口袋被保存为PDBQT格式文件备用。通过调整靶蛋白X—Y—Z坐标和网格大小，优化蛋白质结构结合位点的位置进行分子对接。运行AutoDock Vina软件将处理过的活性化合物对接到目标蛋白质10次，每次对接的最低结合能作为最终结果。最后应用PyMOL软件将结果进行可视化处理，对接复合物。

2 结果

2.1 柴胡-白芍药对活性成分筛选与靶点预测 检索到满足条件的活性成分共计29个，其中柴胡16个，白芍12个，两者共有成分1个。将29个活性成分在TCMSP数据库中进行靶点预测并去重后，得到靶点187个，其中有9个活性成分无法匹配到靶点，因此该187个靶点来自柴胡和白芍中的20个活性成分，其中柴胡12个，白芍7个，两者共有成分1个。

2.2 肝纤维化疾病相关靶点获取及关键靶点筛选 从OMIM数据库中得到152个靶点，从GeneCards数据库中获得7777个靶点，取3次中位数筛选得到973个靶点，取两者的并集得到肝纤维化疾病相关靶点1081个。将柴胡-白芍药对的187个靶点及肝纤维化疾病相关1081个靶点导入Draw Venn Diagram平台进行映射取交集，得到柴胡-白芍药对与肝纤维化疾病相交的靶点共92个，即柴胡-白芍药对治疗肝纤维化的潜在关键靶点，韦恩图见图1。

图1 柴胡-白芍药对靶点与肝纤维化靶点交集韦恩图

2.2 “药对-活性成分-关键靶点-肝纤维化”网络构建 在Excel软件中匹配柴胡-白芍药对20个活性成分和肝纤维化92个关键靶点后发现，有1个柴胡活性成分和2个白芍活性成分无法匹配到疾病的关键靶点，故最终筛选出柴胡-白芍药对的活性成分共17个，见表1。将制作的Network和Type文件导入Cytoscape 3.7.2软件后，绘制“药对-活性成分-关键靶点-肝纤维化”可视化网络图，见图 2。由图2可知，网络共有112个节点和273条边，正方形蓝色节点代表药对，圆形节点代表活性成分(其中粉色节点为柴胡活性成分，紫色节点为白芍活性成分，绿色节点为两者共有活性成分)，菱形红色节点代表关键靶点，三角形橙黄色节点代表肝纤维化，“CH”节点代表柴胡，“BS”节点代表白芍，其余CH&BS、CH1～CH11及BS1～BS5所代表的成分见表1。筛选得到Degree值排名前3的核心成分依次为柴胡的槲皮素(quercetin)(Degree值83)、柴胡和白芍共有的山奈酚(kaempferol)(Degree值31)、白芍的β-谷甾醇(β-sitosterol)(Degree值11)，推测这3种活性成分是柴胡-白芍药对治疗肝纤维化的主要活性成分。

表1 柴胡-白芍药对治疗肝纤维化的活性成分信息

图2 药对-活性成分-关键靶点-肝纤维化调控网络

2.3 药对-肝纤维化关键靶点的PPI构建 将从String平台获得的tsv格式文件导入Cytoscape 3.7.2后，绘制药对-肝纤维化关键靶点的PPI图，包含92个节点和1766条边，节点平均Degree值为38.4，无孤立的节点，见图3。靶点Degree值越大，则在图中的节点越大，颜色越接近网络中心的白细胞介素6(IL-6)节点。筛选出Degree值排名前15的关键靶点共18个，其中有4个靶点Degree值排名并列第15，推测这18个靶点为柴胡、白芍治疗肝纤维化的核心靶点，依次为IL-6(Degree值77)、肿瘤坏死因子(TNF)(Degree值77)、蛋白激酶B1(Akt1)(Degree值76)、TP53(Degree值73)、IL-1β(Degree值73)、血管内皮生长因子A(VEGFA)(Degree值71)、基质金属蛋酶9(MMP-9)(Degree值68)、Jun(Degree值67)、表皮生长因子受体(EGFR)(Degree值65)、CXC趋化因子配体8(CXCL8)(Degree值65)、胱天蛋白酶3(CASP3)(Degree值65)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)(Degree值64)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARG)(Degree值63)、缺氧诱导因子1A(HIF1A)(Degree值62)、MYC(Degree值61)、雌激素受体基因1(ESR1)(Degree值61)、表皮细胞生长因子(EGF)(Degree值61)、趋化因子2(CCL2)(Degree值61)。

图3 柴胡-白芍药对治疗肝纤维化的关键靶点PPI图

2.4 关键靶点的GO富集分析与KEGG富集分析 分析92个靶点得到的GO富集条目5625条，其中BP共4765条，MF共528条，CC共332条。分别以P≤0.01为条件筛选排名前10的富集条目导入微生信平台，绘制GO气泡图(见图4)，其中BP主要涉及脂多糖反应(response to lipopolysaccharide)、无机物反应(response to inorganic substance)、损伤反应(response to wounding)、凋亡信号通路(apoptotic signaling pathway)、细胞移动正调控(positive regulation of cell migration)等过程；MF主要涉及细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、DNA 结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、蛋白结构域特异性结合(protein domain specific binding)等；CC主要涉及囊腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、细胞外基质(extracellular matrix)等。KEGG富集分析显示靶点所在通路共有414条，以P≤0.01为阈值取排名前10的富集条目，绘制气泡图(见图4)其结果涉及癌症通路(pathways in cancer)、糖尿病并发症中的晚期糖基化产物-晚期糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型病毒性肝炎(Hepatitis B)、IL-17 信号通路(IL-17 signaling pathway)、丙型病毒性肝炎(Hepatitis C)等通路。

BP

2.5 关键活性成分与核心靶点的分子对接结果 最终选取了槲皮素、山奈酚及β-谷甾醇这3种关键活性成分与TNF、IL-6、Akt1、TP53、IL-1β这5个核心靶点进行分子对接。在配体结合受体环节，结合能越弱，构象稳定性则越强。一般认为，结合能<-4.25 kcal/mol的配体和受体有一定的结合活性，<-5.0 kcal/mol则说明结合活性较好，<-7.0 kcal/mol则说明结合活性强烈[20-21]。分子对接结果显示，上述3种活性成分分别与5个靶点对接的结合能均<-4.25 kcal/mol，均有一定的结合活性，其中“槲皮素与IL-6、Akt1、TP53”“山奈酚与TNF、IL-6、Akt1、IL-1β”及“β-谷甾醇与IL-6、Akt1、TP53”的结合能<-5.0 kcal/mol，表明这些关键活性成分与核心靶点之间可以形成稳定结构。见表2。

表2 关键活性成分与核心靶点的分子对接结果

3 讨论

通过上述研究我们发现，柴胡-白芍药对治疗肝纤维化的3种主要活性成分为槲皮素、山奈酚及β-谷甾醇。槲皮素是一种黄酮类多酚化合物，通常以槲皮素糖苷的形式存在于天然植物中，具有抗纤维化、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒等作用，亦可用作营养补充剂[22]。细胞损伤会促进炎症因子的分泌，是肝纤维化发病的最初因素，而槲皮素可以保护急性肝细胞损伤，从而阻止肝脏进一步纤维化[23]。有体外细胞实验表明，槲皮素还可以通过调控肝纤维化过程中起主导作用的肝星状细胞，抑制胶原蛋白的分泌和细胞外基质的产生[24]，抑制胶原聚集，降低胶原总量来抑制甚至逆转肝纤维化[25-26]。槲皮素的抗炎作用可以通过负调节Toll样受体(TLR)，从而抑制脂多糖诱导膜表面的黏附分子及IL-1、IL-6、IL-10等炎症因子表达来实现[27]。还有研究报道显示，槲皮素抗肿瘤的作用不局限于直接抑制肿瘤发展，还可以通过增强其他合用药物的疗效来间接增强抗肿瘤疗效，抑制癌前病变[28]。山奈酚亦是一种黄酮类多酚化合物，大量存在于水果、蔬菜及中药材中，具有抗炎、抗氧化、抗癌、保护损伤组织等作用，是重要的膳食抗炎剂[29]。山奈酚的抗炎和抗肿瘤作用显著，能明显抑制炎性细胞浸润，被用于治疗骨关节炎、结肠炎、呼吸窘迫综合征等多种急慢性炎症疾病，以及肝细胞癌、食管癌、乳腺癌等多种癌症[30]。有研究表明，山奈酚可以通过调节肠道紧密连接蛋白、丁酸受体及转运蛋白来减轻肝损伤[31]，并通过抑制胶原的合成和肝星状细胞的活化，激活活化素受体样激酶5来显著改善肝纤维化的形成[32]。β-谷甾醇属于植物甾醇类成分，在植物油中含量较高，具有抗炎、抗氧化、降低胆固醇、免疫调节等作用[33]。实验研究显示，β-谷甾醇具有强大的抗炎活性，其效果类似于腹腔注射氢化可的松和羟基保泰松[34]。有研究表明，β-谷甾醇可以通过抑制一氧化氮(NO)合成和IL-6活性，减少TNF-α、IL-1β等炎症因子的分泌来实现抗炎作用[35]。β-谷甾醇还可以通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径下调凋亡相关基因的表达，从而实现对慢性酒精性肝损伤的保护[36]。

自然界植物中大部分的槲皮素和山奈酚是依附于糖基存在的，糖的种类和附着物影响其OB，从而影响其生物活性[37]，且槲皮素水溶性差，稳定性低[38]。近年来有一些增加槲皮素溶解度的相关研究，致力于增加其可溶性，以提高OB，并取得了一定的研究成果[39]。TCSMP检索到槲皮素、山奈酚的OB值分别为46.43%和41.88%，处于中等水平。我们认为可以进一步研究分析柴胡和白芍中糖类化合物种类，从而在临床上联合应用糖类化合物，以增加有效成分的OB。此外，在临床应用柴胡类经方治疗肝纤维化时，是否应灵活加大柴胡和白芍的用量，以提高入血的成分浓度，使其充分发挥疗效，也是有待考究的问题。

根据PPI图分析可以发现，TNF、IL-6、Akt1、TP53、IL-1β等靶点的Degree值较高，是柴胡-白芍药对干预肝纤维化的潜在核心靶点，也是连接其他节点的核心枢纽。TNF主要来源于巨噬细胞和免疫细胞，可以调节固有免疫和适应性免疫，是免疫系统的一个关键调节成分，亦是慢性炎症性疾病的有效治疗手段，但其在机体感染或组织损伤时却又会被激活，进一步诱导并维持炎症发生[40-41]。此外，TNF既对肿瘤细胞有细胞毒作用，又可作为强大的致炎因子，诱导肿瘤发生[42]。IL-6是人体内重要的炎症因子，可以促进肝内的炎性反应，介导肝细胞损伤，诱导细胞分化增殖，刺激纤维组织不断增生，使慢性肝脏炎症持续发展[43]。Akt1则在酒精性肝病病情发展的各个环节发挥着核心作用，其中包括促进细胞增殖、迁移和转录，同时可损害细胞导致其凋亡，进一步导致纤维化的发生发展，有研究表明Akt1可能以PI3K依赖的方式被类似的信号通路激活[44]。TP53是肝细胞癌重要的启动基因之一，TP53伴乙型肝炎病毒引起的肝硬化被认为是第二危险的基因组合[45]。IL-1β是最早被发现的细胞因子之一，由成纤维细胞、免疫细胞及癌细胞等多种细胞产生和分泌，长期以来被视为疾病发展过程中介导炎症及调节生理的重要因子[46]。有研究显示，抗癌治疗能够促进癌细胞或免疫细胞产生IL-1β，对癌症的发展具有抑制作用[47]。总而言之，本研究显示强相关的靶点对于肝纤维化进程具有正向、负向或双向调控作用，有待进一步明确其中共同参与调控的相关因子和通路，以为肝纤维化的治疗明晰方向。

GO富集分析结果显示，脂多糖反应和无机物反应是最主要的2个生物过程，囊腔是柴胡-白芍药对发挥治疗作用的主要细胞组成，分子功能主要涉及调节细胞因子受体结合及DNA结合转录因子。囊腔是细胞内质网的基本组成结构，内质网的功能可以概括为蛋白质和膜脂质的合成和输出，外与细胞膜相连,内与核膜的外膜相通,将细胞内的各种结构有机地联结成一个整体，其中滑面内质网还具有解毒功能，如肝细胞中的滑面内质网可以清除脂溶性的废物和代谢产生的多种有害物质。故推测囊腔是柴胡-白芍药对治疗肝纤维化在细胞内的主要作用位置。在正常情况下，脂多糖是大多数革兰阴性菌细胞壁的重要组成部分，亦可由乙醇等物质代谢产生[48]。然而脂多糖对机体也存在一定的毒害作用，在肝细胞病理状态下，脂多糖会诱导氧化应激、细胞因子释放及免疫细胞浸润，从而导致肝细胞更容易受二次损害，导致肝脏损伤和纤维化持续存在[49]。由此推测，柴胡-白芍药对可能通过调节脂多糖代谢来减少机体不良化学反应的发生，从而减少肝脏损伤和纤维化。肝纤维化还与肝内的无机物反应密切相关。有研究发现，亚砷酸盐会使肝脏发生氧化损伤，进而诱导肝细胞角蛋白18(CK18)中Ⅰ型细胞角蛋白的表达，从而进一步引发肝纤维化甚至形成肿瘤[50]。故推测柴胡-白芍药对可能通过阻止外来吸收或代谢内生的无机物累积作用于肝细胞，从而减轻无机物对肝脏的不良影响。

KEGG富集分析结果显示，富集靶点数目最多的是癌症通路，此外还有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等。已有大量研究表明，肝纤维化是一个非常主要的癌前病变，在Tsuchida T等[51]构建的肝病发展模型中，表观遗传学变化可表现为“脂肪变性→炎症→纤维化→癌症”。现有研究表明，肝脏成纤维细胞主要来源于肝脏驻留的造血干细胞、间皮细胞及活化的门管区成纤维细胞[52]。在肝纤维化进程中，许多相关因子对纤维化影响的研究结果尚未统一。如有研究结果显示，IL-22可抑制肝纤维化，但也有研究认为IL-22在乙型肝炎患者和乙型肝炎小鼠模型中具有促炎和促纤维化作用[53]。推测柴胡-白芍药对可能通过平衡调控其中的一种或多种因子，从而阻止肝纤维化的发生或进展，防止其向肝癌发生转变，充分发挥中医药“未病先防”“既病防变”的治疗作用。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路也是肝纤维化的一个重要通路。研究显示，黄腐酚可以通过介导NF-E2相关因子2(NRF2)/RAGE/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路，减轻2型糖尿病诱导的肝脏脂肪变性和纤维化[54]。这提示柴胡-白芍药对可能对糖尿病并发的肝纤维化有明显疗效，但现有相关研究较少。

最后，为验证网络药理学预测的准确性，本研究选取柴胡-黄芩药对中的主要活性成分与核心靶点进行分子对接。分子对接结果显示，槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇与核心靶点之间的结合活性较高，进一步证明了网络药理学的结果。

综上所述，通过网络药理学及分子对接方法，初步阐述了柴胡-白芍药对治疗肝纤维化可能相关的多个关键靶点、活性成分、生物学过程及信号通路等协同作用的分子机制，主要作用靶点集中在囊腔中由脂多糖反应终末产物介导的癌症通路，为今后进一步探索柴胡-白芍药对治疗肝纤维化丰富了理论基础，也为后续关于柴胡、白芍药对治疗肝纤维化的药理实验研究提供了参考思路。