结直肠癌不同病理特征患者化疗前后循环肿瘤DNA水平变化及预后预测的列线图模型构建

李程，闫柯，霍斌亮，李文翰，赵刚

结直肠癌是当前癌症死亡主因之一，目前化疗仍是晚期结直肠癌首要治疗手段，但5年生存率仅10%左右[1-2]。可靠的评估技术对改善结直肠癌患者预后、指导制定治疗方案、延长患者生存期具有重要作用。临床研究证实，基因突变是结直肠癌发病的分子生物学重要驱动机制，且持续存在的基因突变可驱动结直肠癌克隆进化[3]。组织活检是临床评估肿瘤组织形态及细胞克隆进化情况的“金标准”，但其可重复性差，而液体活检是近年新兴癌症检查技术，同时中外学者最新研究表明，肿瘤所释放的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)与肿瘤组织内DNA呈高度一致性[4-5]。基于此，现观察结直肠癌不同病理特征患者化疗前后循环肿瘤DNA水平变化，并构建预后预测的列线图模型，为临床完善相关评估机制提供参考，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年4月—2019年9月陕西省人民医院肿瘤外科收治的结直肠癌患者144例作为观察组，同期结直肠良性瘤患者72例作为对照Ⅰ组，健康体检者72例作为对照Ⅱ组。观察组男83例，女61例，年龄29～73(51.46±9.38)岁；体质量指数18～25(21.16±1.25)kg/m2；饮食习惯：喜肥甘77例，喜清淡36例，均衡31例；吸烟105例，饮酒83例。对照Ⅰ组男40例，女32例，年龄27～75(52.58±9.20)岁；体质量指数18～25(21.21±1.30)kg/m2；饮食习惯：喜肥甘37例，喜清淡19例，均衡16例；吸烟52例，饮酒40例。对照Ⅱ组男41例，女31例，年龄28～73(50.91±8.34)岁；体质量指数18～24(21.08±1.28)kg/m2；饮食习惯：喜肥甘29例，喜清淡22例，均衡21例；吸烟50例，饮酒42例。3组性别、年龄、体质量指数、饮食习惯、吸烟、饮酒等基础资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(KY20160325098)，受试者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：观察组经病理检查确诊[6]；TNM分期为Ⅲb～Ⅳ期；卡氏评分(KPS)>70分；首次确诊，入组前未经相关治疗；均接受化疗；预计生存期>3个月；心、肺、肝、肾脏器功能正常。(2)排除标准：存在化疗禁忌证者；有恶性肿瘤史；同时性多原发性肿瘤。

1.3 化疗方法 结直肠癌患者144例均根据病理特征常规选择XELOX方案或FOLFOX4方案化疗，3周为1个疗程，均进行3个疗程，化疗后随访2年，统计观察组患者生存情况。

1.4 观测指标与方法

1.4.1 ctDNA水平检测：以EDTA抗凝管采集3组人员清晨空腹肘静脉血4 ml，颠倒混匀，移至离心管，并加等体积磷酸盐缓冲液，常温离心，去除上清液，沉淀置于裂解缓冲液内，37 ℃水浴1 h；移液管取蛋白酶K 20 μl加入1.5 ml微量离心管内[范德(北京)生物科技有限责任公司]，再加温浴后的标本5 μl，加PBS调容至220 μl，加缓冲液AL 200 μl，振荡，孵育10 min(56℃)，加乙醇200 μl，混匀，移液枪(上海恒奇仪器仪表有限公司移液枪)移取混合液至DNeasy Mini spin column，离心，弃上清液，将DNeasy Mini spin column移至2 ml新收集管，加缓冲液AW1，离心1 min(8 000 rpm)，弃采集管，并移至2 ml新收集管，加适量AW2，离心3 min(14 000 rmp)，弃采集管，再次移至新微量离心管(2 ml)，移液枪取缓冲液AE 200 μl加入DNeasy membrane，室温孵育1 min，离心1 min(8 000 rpm)，洗脱，收集ctDNA。取样本1 μl于260 nm波长紫外线可见光度计(上海精密科学仪器有限公司UV-5500型)下测吸光度值，参照吸光度标准曲线获得ctDNA水平。

2 结 果

2.1 3组ctDNA水平比较 观察组、对照Ⅰ组、对照Ⅱ组ctDNA水平分别为(142.58±45.59)μg/L、(78.69±24.76)μg/L和(38.65±11.35)μg/L，3组比较观察组>对照Ⅰ组>对照Ⅱ组，差异均有统计学意义(F/P=229.968/<0.001)。

2.2 观察组不同病理特征患者化疗前/后ctDNA水平比较 不同肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、T分期患者化疗前/后ctDNA水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同组织学类型患者化疗前/后ctDNA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 观察组不同病理特征患者化疗前/后ctDNA水平比较

2.3 影响结直肠癌患者预后的单因素分析 随访2年，144例患者脱落8例，有效随访136例，生存54例，病死82例。结直肠癌患者预后与性别、体质量指数、饮食习惯、不良生活习惯、化疗方案无关(P>0.05)；结直肠癌患者年龄≥50岁、肿瘤直径>5 cm、分化程度低、浸润深度突破浆膜层、有淋巴结转移、T分期T4、化疗前/后ctDNA水平≥142.58/86.59 μg/L者生存率低(P<0.05)，见表2。

表2 不同临床病理特征结直肠癌患者预后情况比较 [例(%)]

2.4 影响结直肠癌患者预后的多因素分析 将表2中P<0.05项目作为自变量(年龄<50岁=1，≥50岁=2；肿瘤直径≤5 cm=1，>5 cm=2；分化程度低=1，中—高分化=2；浸润深度未突破浆膜层=0，突破浆膜层=1；淋巴结转移：否=0，是=1；T分期T1～T3=1，T4=2)，预后(生存=0，病死=1)作为因变量，纳入Cox回归模型，结果显示，分化程度、淋巴结转移、T分期、化疗后ctDNA水平均是结直肠癌预后的独立影响因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响结直肠癌患者预后的Cox回归模型分析

2.5 结直肠癌预后的列线图模型构建 应用Cox回归模型筛选出的分化程度、淋巴结转移、T分期、化疗后ctDNA水平构建结直肠癌患者预后列线图预测模型，一致性指数为0.892。校正曲线分析显示，预测模型预测病死风险与实际病死风险吻合度较高，见图1、2。

图1 结直肠癌患者预后列线图预测模型

3 讨 论

目前结直肠癌已成为世界第三大恶性肿瘤[7]。据统计，我国结直肠癌发病率约占全球24.3%，且其发病率在大城市以年均4%～5%的速度递增[8-9]。但结直肠癌并非绝对绝症，其中1/3可预防，1/3可达临床治愈，还有1/3通过有效治疗可提升生存质量，延长生存期[10]。但如何评估结直肠癌患者病情转归，指导完善治疗方案是困扰临床的一大难题。

图2 结直肠癌患者预后列线图预测模型的校正曲线

近年随分子生物学研究深入，不断有研究提出基因检测在肿瘤诊断及病情评估中存在独特优势[11-12]。循环游离DNA是无细胞状态的一种胞外DNA，除少部分来自正常细胞DNA外，大部分来自肿瘤细胞。ctDNA相对于组织学活检能从循环血内易分离，具有无创、便捷等优势，且ctDNA来自于各处病灶，能为临床提供实时、全面的病情评估信息[13]。Benesová等[14]研究指出，转移性大肠癌患者ctDNA普遍阳性，且水平与患者实际临床状态有关。本研究发现，结直肠肿瘤患者ctDNA呈升高趋势，且恶性患者升高更显著，与以往研究结果一致[15-16]。此外，本研究还发现，化疗前后ctDNA水平与肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、T分期均有关系。分析原因可能是：(1)随肿瘤直径增大，恶性细胞增殖活跃，同时凋亡细胞增加，而“清道夫”细胞无法及时有效清除急剧增加的恶性细胞及凋亡细胞时，直接造成ctDNA显著升高[17]；(2)T分期较高及突破浆膜层的患者，可能同时存在多处微小转移灶，而微小转移灶内恶性细胞凋亡、裂解也会增加外周血ctDNA水平[18]；(3)多项研究已证实，低分化组织内多分布脉管癌栓，而一定程度上脉管癌栓在增加微小转移灶的同时可影响病灶局部血流供给，导致恶性细胞凋亡释放ctDNA入血[19]。上述研究提示，ctDNA可能与结直肠癌发生发展有关，或可为临床提供预后预测信息。

相关研究也指出，结直肠癌患者预后是一个多因素综合作用的结果。蒋苏静[20]以SEER数据库中698例原发性十二指肠腺癌患者为研究对象发现，年龄、肿瘤分化、淋巴结转移是其预后不良的独立影响因素；韩晶等[21]未发现年龄与结直肠癌根治性切除术预后有关，组织学类型、TNM分期是此类患者预后的独立影响因素。本研究对化疗结直肠癌患者研究发现，不同预后患者间年龄、肿瘤直径、分化程度等存在差异，但组织学类型与预后无相关性，与上述研究存在一定异同，此特征可能与样本量选取、病例个体差异等因素有关，上述研究均说明单纯从病理特征层面可能难以为临床提供准确的预后预测信息。本研究采用Cox回归模型分析发现，T分期、淋巴结转移、分化程度、化疗后ctDNA水平均是结直肠癌预后的独立影响因素，且化疗后随ctDNA水平增加，病死风险随之增加。进一步构建结直肠癌患者预后的列线图预测模型发现，当低分化、淋巴结转移、T4期单独存在时结直肠癌患者随访期病死风险尚不足10%，而化疗后ctDNA水平≥86.59 μg/L单独存在时随访期病死风险接近20%。初看此数据与临床不符，主要是因本研究选取病例为晚期结直肠癌患者，此阶段患者病情特征复杂，往往低分化、淋巴结转移、T4期及ctDNA高水平同时存在，临床在预后评估中应注重ctDNA水平的检测。结直肠癌患者预后列线图预测模型的校正曲线与标准曲线一致性指数为0.892，客观说明此列线图预测模型具有较高实用价值。

综上，结直肠癌患者ctDNA水平与病理特征有关，且采用列线图模型预测此类患者预后时ctDNA水平优势显著，或能成为临床完善结直肠癌患者预后评估机制的有力补充。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

李程：提出研究思路，设计研究方案，课题设计，论文撰写，论文修改；闫柯：实施研究过程，资料搜集整理；霍斌亮：论文审核；李文翰、赵刚：进行统计学分析，资料搜集整理