非编码RNAs在卵巢癌早期诊断中的研究进展

高宇峰综述 王元审校

据报道，2020年在全球范围内有31万余名妇女被诊断患有卵巢癌，并造成了近21万人死亡，5年生存率仅45%，使卵巢癌成为第九大最常见的癌症和第九大最常见的妇女癌症死亡原因[1]。90%卵巢癌是上皮性的，最常见的病理类型是浆液性癌。大多数浆液性卵巢癌被诊断为Ⅲ期(51%)或Ⅳ期(29%)，其5年病因特异性生存率分别为42%和26%。大多数患者在最初诊断时已是晚期，治疗相当棘手[2]。因此，如何早期诊断卵巢癌是一件急需解决的临床问题。非编码RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)是一类对于细胞至关重要的且不编码蛋白质的特殊RNA群体，包括miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、circRNA等。虽然非编码RNA不直接参与蛋白质的翻译过程，但这些转录因子在影响基因表达、调控蛋白质功能方面发挥着重要作用，进而影响着疾病的进展[3]。非编码RNAs在宫颈癌、结直肠癌、前列腺癌早期诊断中已有相关的研究报道[4-6]。但是关于非编码RNAs在卵巢癌早期诊断的应用仍存在争议。与肿瘤发生和发展相关的ncRNAs类别包括miRNAs、lncRNAs、ceRNA、exo-ncRNAs、circRNAs。寻找有意义的新型非编码RNAs生物标志物应用于卵巢癌患者的早期诊断具有重大的临床意义。

1 非编码RNAs概述

非编码RNAs是指不编码蛋白质但对细胞至关重要的RNA群体[3]。其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、miRNA等多种已知功能的 RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是均能从基因组上转录而来，但是不翻译为蛋白，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能。非编码RNAs从长度上来划分可分为3类：小于50 nt，包括microRNA、siRNA、piRNA；50～500 nt，包括rRNA、tRNA、snRNA等；大于500 nt，包括长mRNA-like 的非编码RNA，长不带polyA 尾巴的非编码RNA等。非编码RNAs广泛参与生命现象的各个环节，如生长、分化、发育、免疫，并且在肿瘤的形成中也具有重要的调控作用。

2 miRNA 在卵巢癌早期诊断中的应用

Berner等[7]研究发现，在卵巢癌细胞内、细胞外和尿液中的miRNA表达有变化，强调了它们作为液体活检生物标志物的巨大潜力。特别是miR-15a和let-7a有希望成为卵巢癌患者液体活检中可能的循环生物标志物。进一步的研究可能有更多的证据表明miR-15a在卵巢癌早期诊断中的潜在临床意义。

高级别浆液性癌(high grade serous carcinoma，HGSC)是上皮性卵巢癌中最常见的组织学亚型，且致死率高。Hannan等[8]发现，循环的miR-200c可能是检测HGSC的一个有希望的候选生物标志物。但是这项研究需要进一步更大的队列研究，以确定循环miR-200c是否可能作为卵巢癌敏感和特异的生物标志物。

采用子宫输卵管灌洗术，Hulstaert 等[9]在卵巢癌样本中找到超过300个mRNAs和41个miRNAs被上调。虽然子宫—输卵管灌洗液的mRNA捕获测序在技术上是可行的，但是因其是借助手术的方式取材，所以在技术推广、计划的可实施性上存在一定的难度。但是针对因遗传因素易患卵巢癌的群体是有价值的。

任玉峰等[10]通过检测上皮性卵巢癌良恶性组的miRNA表达水平得出结论，上皮性卵巢癌患者血浆中miR-196a表达水平升高，miR-1285表达水平降低，且miR-196a和miR-1285 对上皮性卵巢癌均具有一定的诊断价值，可独立作为上皮性卵巢癌早期诊断的新型肿瘤预测标志物。此外，基于生物信息学分析的研究，10种miRNA被预测为具有作为血浆生物标志物的潜能[11]。但由于生物信息学分析方法只是提供了一种理论依据，在实际应用中，还需要更多的实验证据加以支撑。

Sung等[12]开发了先进的集成微流控平台，用于分离和量化卵巢癌血液中的生物标志物miRNA-21。临床试验证实了这种集成平台在临床上的适用性，意味着这种自动化和高敏感度的集成微流控平台用于miRNA定量，可以用于卵巢癌生物标志物的测量。

因此，循环miRNAs作为非侵入性生物标志物在卵巢癌的早期临床诊断中具有一定的潜在价值。

3 lncRNA在卵巢癌早期诊断中的应用

KCNQ1对侧链/反义转录本1(KCNQ1OT1)编码CDKN1C/KCNQ1OT1簇中KCNQ1对侧链的lncRNA，在癌症的发生和发展中起着重要作用[13]。KCNQ1OT1调节癌细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭、转移、葡萄糖代谢和免疫逃逸。癌症患者中KCNQ1OT1的异常表达与预后不良和生存率下降有关。Luo等[14]通过实验证实卵巢癌细胞中lncRNA KCNQ1OT1的增加促进了β-catenin的表达，从而有利于卵巢癌细胞的增殖和迁移。总之，这些结果表明，KCNQ1OT1可能在卵巢癌的发展中起作用，并可作为生物标志物在早期阶段检测出该癌症。

在一项研究中，42对卵巢癌肿瘤组织和临近正常组织qRT-PCR结果显示，PCAT6(prostate cancer-associated transcript 6)在卵巢癌中的表达水平高于邻近的正常组织[15]。PCAT6是一种lncRNA，最早发现于2013年[16]。这种致癌的lncRNA已被发现在不同的组织中调节致癌过程，因此其作为卵巢癌早期诊断指标的特异性存在争议，有待进一步的研究，寻找可能的亚型表达。基于同样的检测方法，周倩等[17]发现，卵巢癌患者血清中的lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1升高。lncRNA EWSAT1+SPRY4-IT1联合筛查方法诊断卵巢癌具有敏感度、特异度、准确度高的特点，适合在临床上推广应用。lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1低表达的卵巢癌患者具有较好的预后。

LncRNA GAS8-AS1在卵巢癌组织和细胞系中减少，GAS8-AS1的高表达表明卵巢癌患者5年生存率更高。GAS8-AS1的过量表达抑制了卵巢癌细胞的生长，而GAS8-AS1的缺失促进了卵巢癌细胞的进展[18]。这些发现表明，GAS8-AS1转录产物的水平可以作为卵巢癌新的生物标志物。此外研究也表明，GAS8-AS1可能是卵巢癌诊断和预后的一个有应用前景的生物标志物，也可能是卵巢癌治疗的新目标[19]。

近年来，lncRNAs在卵巢癌的研究不断深入，长链非编码RNAs将带来更多的发现，并且这些发现应用于卵巢癌早期诊断的前景有待关注。关于长链非编码RNAs在卵巢癌研究成果的初步成功，为更进一步的研究奠定了基础。

4 ceRNA在卵巢癌早期诊断中的应用

miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNA(competing endogenous RNAs)可以通过竞争性地结合miRNA来调节基因表达。ceRNA可以通过应答原件(miRNA response elements，MREs)与miRNA结合从而使miRNA失效，这揭示了一条RNA到miRNA调节通路的存在[20]。因此，ceRNA在肿瘤发生发展中可能同样发挥着作用。一项研究表明，SLC7A11通过与STX17、RAB33B和 UVRAG 3个基因的ceRNA相互作用在耐药的卵巢癌中调节自噬。此外，STX17和UVRAG的低表达也可显著预测低的总生存期(overall survival，OS)、无进展生存期(progression-free survival，PFS)和后进展生存期(post progression survival，PPS)[21]，因此该基因可以作为卵巢癌的治疗目标和潜在的生物标志物。另外一项研究表明，NCALD作为CX3CL1的ceRNA，其下调可能影响卵巢癌的预后。因此，NCALD可能是一个新的抗癌治疗靶点和一个新的卵巢癌生存预测的生物标志物[22]。

5 外泌体非编码RNA(exo-ncRNAs)在卵巢癌早期诊断中的应用

不同来源的外泌体囊泡内所包含的物质有所差别，特别是人体循环中的外泌体非编码RNA 表达水平于不同生理条件下会发生变化。可见，外泌体非编码RNA 具有作为生物标志物的潜力[23]。近年来更多的研究集中在外泌体非编码RNAs上，因为它是lncRNAs和miRNAs的天然载体[24]。

Pan等[25]研究发现，血浆外泌体miR-200b在卵巢癌患者中的表达水平是正常人的5倍，因此血浆外泌体miR-200b可以与CA125联合检测，这对提高卵巢癌的诊断敏感度和特异度是有意义的。但是 Kim等[26]认为外泌体miR-200b 的表达过低而不利于作为诊断标志物。随后在患者血浆中找到另一种外泌体miR-145，发现其在血浆中的表达高于miR-200b，对诊断卵巢癌有潜在意义。

外泌体circRNA稳定地存在于体液中，其磷脂双分子层可以保护circRNA不被降解，并通过质膜融合发挥其生物学功能，因此检测外泌体circRNA可以作为一种新的、微创的生物学标志物，用于各种癌症的检测[27-29]。Zong等[30]发现circWHSC1在卵巢癌组织中上调，并且circWHSC1在中度和低度分化的卵巢癌组织中的表达高于分化良好的卵巢癌组织。外泌体circWHSC1可以转移到腹膜间皮细胞并促进癌症的腹膜传播。由此可见，外泌体circWHSC1对于早期诊断卵巢癌是有帮助的。

从这些前期的研究中看出，外泌体ncRNAs可以作为卵巢癌的新的诊断生物标志物[31]。但是，目前关于这一领域的研究仍较少，且仍处于临床前阶段。因此，未来需要进行多中心和大规模的临床研究来验证外泌体非编码RNA在卵巢癌早期诊断中的作用。

6 circRNAs在卵巢癌早期诊断中的应用

环状RNA(circRNAs)是一种内源性RNA，具有共价封闭的连续环状结构，没有5′帽或3′聚A尾。由于其环状的结构，circRNA比线性RNA更稳定，可以抵抗RNA衰变[32]。

Chen等[33]发现，circASH2L在卵巢癌中具有致癌功能。circASH2L通过miR-665/VEGFA轴调节卵巢癌细胞的肿瘤发生、血管生成和淋巴管生成方面起着关键作用，因此，它可能是卵巢癌治疗的一个候选目标。circGFRA1同样在卵巢癌组织中过量表达[34]。抑制circGFRA1能抑制细胞增殖和侵袭，但能诱导卵巢癌的细胞凋亡。双荧光素酶报告(dual- luciferase reporter assay,DR)和RNA 结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation assay，RIP)检测显示，circGFRA1可以通过海绵化miR-449a调节GFRA1的表达。因此，circGFRA1可能是一个潜在的卵巢癌诊断生物标志物和治疗目标。

circKIF4A在卵巢癌组织中高度表达。敲除circKIF4A可抑制卵巢癌的细胞增殖和迁移。随后的机制研究发现，circKIF4A通过疏导miR-127和上调结缔组织黏附分子3(JAM3)的表达来促进卵巢癌的发展[35]。因此，circKIF4A可能是卵巢癌一个新的生物标志物。总之，由于circRNAs的结构稳定性，其作为生物标志物在卵巢癌早期诊断中具有很大的潜在价值。

7 小结与展望

卵巢癌通常在癌症的晚期阶段才被诊断出来，一部分原因是缺乏有效的筛查策略和手段。尽管许多生物标志物已经被研究并用于评估卵巢癌的状态、进展和药物治疗的疗效。但现有的检测方法在卵巢癌的早期诊断中仍有很大的局限性。在与肿瘤发生和发展相关的ncRNAs类别中，有miRNAs、lncRNAs、ceRNA、exo-ncRNAs、circRNAs。因此寻找有意义的新型非编码RNAs标志物应用于卵巢癌患者的早期诊断具有重大的临床意义。虽然在卵巢癌早期阶段，发挥重要作用的非编码RNAs仍然不清楚，但是随着高通量测序时代的到来，低成本、高效率、普适化的检测可能进一步应用到卵巢癌的早期诊断中，并将对卵巢癌患者的治疗、预后产生积极有益的影响。