酸水解法测定大豆中脂肪含量的方法优化

张 澜，贺文娟，徐美鑫，石 盟

（日照市质量检验检测研究院，山东日照 276800）

脂肪是食品标准中常见的检验项目，是营养标签之一[1]，不同食品的脂肪测定方法也不同。大豆富含丰富的蛋白质、脂肪、维生素及膳食纤维，具有药食两用的价值。大豆中脂肪含量测定适用于GB 5009.6—2016[2]。目前，《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）中规定了4 种检验方法，大豆适用于第一法索氏抽提法和第二法酸水解法，索氏抽提法测定的是游离态脂肪含量，酸水解法测定的是游离态和结合态脂肪的总含量。酸水解法更能反映出大豆中脂肪含量。但GB 5009.6—2016 酸水解法的操作方法笼统[3]，检测结果平行性差，结果不稳定[4]。

为了准确测定大豆的脂肪含量，对GB 5009.6—2016 酸水解法进行方法优化，优化后的检测结果更为稳定可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器

AG285 型分析天平（0.1 mg），梅特勒-托利多仪器产品；具塞圆底试管（100 mL）、试管（50 mL）、具塞量筒（100 mL）；恒温水浴锅：室温～99.9 ℃；BGZ-240 型电热鼓风干燥箱（室温～300 ℃），上海博迅实业有限公司产品。

1.2 试剂

盐酸（AR）、无水乙醇（AR）、乙醚（AR）、石油醚（AR）、沸程30～60 ℃、三级水。

1.3 试验材料

普通大豆样品，市售；大豆粉质控样。

1.4 试验方法

1.4.1 样品前处理

称取样品2～5 g，置于100 mL 具塞圆底试管内，加入8 mL 水，混匀后再加10 mL 盐酸（2 mol/L）。将试管放入70～80 ℃水浴中，每隔5～10 min，以玻璃棒搅拌1 次，至试样消化完全为止，需要40～50 min。

1.4.2 抽提

取出试管，加入10 mL 乙醇，混合。冷却后以25 mL 无水乙醚分数次清洗玻璃棒，待无水乙醚全部倒入量筒后，加塞振摇1 min，小心开塞，放出气体，再塞好，静置12 min，小心开塞，并用乙醚冲洗塞及量筒口附着的脂肪。静置10～20 min，待上部液体清晰，用一次性吸管吸出上清液于已恒质量的锥形瓶内，再加5 mL 无水乙醚于具塞量筒内，振摇，静置后仍将上层乙醚吸出，放入原锥形瓶内。

1.4.3 称量

水浴上蒸干，于100±5 ℃条件下干燥1 h，放干燥器内冷却0.5 h 后称量。重复以上操作直至恒重（直至2 次称量的差不超过2 mg）。

1.4.4 计算

计算方法同国标，此略。

1.5 试验条件优化

1.5.1 样品制备优化

大豆粉碎后分别过20，40，60，80 目筛，得到粒度不同的4 种粉碎后样品，按照1.4 分别进行脂肪含量测定，研究大豆粒度对脂肪抽提的影响，选择最优粒度进行含量测定。

1.5.2 试样称量及处理过程

按照GB 5009.6 进行大豆脂肪含量提取时，试验称量所用容器具及处理过程直接影响脂肪的回收率，因此进行试样称量及处理过程优化试验。

分别按照标准方法（即样品称取到50 mL 试管，水解后转移至100 mL 具塞量筒）、样品直接称取到100 mL 具塞量筒、样品直接称取到100 mL 具塞圆底试管，3 种前处理进行试验。

1.5.3 抽提溶剂优化

分别选用乙醚、乙醚∶石油醚（1∶1）、石油醚等溶剂进行脂肪抽提，以期选择最佳的抽提溶剂。

1.5.4 抽提次数优化

按照GB 5009.6 进行大豆脂肪含量提取时，脂肪抽提次数是大豆脂肪含量测定的关键影响因素。因此实验室分别进行2，3，4 次溶剂抽提，以期选择最优抽提次数。

2 结果与分析

2.1 样品处理

不同粒度大豆粉脂肪含量测定见表1。

表1 不同粒度大豆粉脂肪含量测定 /%

由表1 可知，大豆粒度从20～80 目，目数越大粒度越小，其脂肪测定值越大。20，40 目的大豆粉脂肪含量测定值分别为11.9%，14.8%远小于60 目（16.8%）和80 目（17.1%）的大豆粉；而60 目与80 目的大豆粉脂肪测定值相近，所以在大豆样品制备中应选择60 目以上的大豆粉碎样品进行脂肪含量测定。

2.2 试样称量及处理过程

不同称量及处理过程大豆粉脂肪含量测定见表2。

表2 不同称量及处理过程大豆粉脂肪含量测定 /%

由表2 可知，3 种不同的试样称量及处理过程，样品由50 mL 试管转移至100 mL 具塞量筒的处理过程，有中间转移步骤，大豆粉脂肪测定值为15.1%，低于没有转移步骤的大豆粉脂肪测定值（16.1%，16.6%），说明脂肪在转移过程中有损耗。

样品直接称取到100 mL 具塞量筒处理过程的RSD 值大于样品直接称取到100 mL 具塞圆底试管处理过程的RSD 值，即使用具塞圆底试管的平行性优于使用具塞量筒。试验过程中发现，具塞量筒底部为直角，加水混匀时大豆粉易在直角处堆积，无法用水溶解，具塞圆底试管底部为圆弧型，加水溶解大豆粉不易堆积。所以，在试样称量处理过程中应选择样品直接称取到100 mL 具塞圆底试管中。

2.3 抽提试剂

不同抽提溶剂大豆粉脂肪含量测定见表3。

表3 不同抽提溶剂大豆粉脂肪含量测定 /%

3 种试剂抽提大豆粉脂肪测定值对比，乙醚（16.7%）＞乙醚：石油醚=1∶1（12.8%）＞石油醚（10.1%），石油醚溶解脂肪能力比乙醚低，石油醚的提取效率低于乙醚，所以抽提溶剂应选择乙醚。

2.4 抽提次数

不同抽提次数大豆粉脂肪含量测定见表4。

表4 不同抽提次数大豆粉脂肪含量测定 /%

由表4 可知，抽提2 次的大豆粉脂肪测定值（15.4%）明显小于抽提3 次（16.9%）和4 次（17.0%）的大豆粉脂肪测定值，而抽提3 次和抽提4 次大豆粉脂肪测定值相差不大，所以在大豆粉脂肪含量测定中应选择抽提3 次进行试验。

2.5 条件优化前后对比

为了验证优化的试验条件，购买了大豆粉中脂肪含量质控样品，进行标准方法与优化后的方法进行比较。

条件优化前后大豆粉脂肪含量测定见表5。

表5 条件优化前后大豆粉脂肪含量测定 /%

使用市售大豆粉质控样（脂肪指定值为16.99%，标准差为0.47%）对试验条件优化进行验证，质控样品测试结果评价方法采用“Z-比分数”评价，当ⅠZⅠ≤2，测试结果为满意；当2＜ⅠZⅠ＜3，测试结果为可疑。条件优化前大豆粉脂肪测定值为15.6%，Z值为2.96，测试结果可疑。

由表5 可知，条件优化后大豆粉脂肪测定值为16.3%，Z值为1.47，测试结果满意。

3 结论

脂肪作为食品检测行业中的一个重要指标，准确测定脂肪含量具有非常重要的意义。对酸水解测定大豆粉中脂肪含量的检测条件进行优化，综合条件优化前后数据来看，大豆样品制备中应选择60 目以上的大豆粉碎样品，脂肪提取效果更好；样品直接称取到100 mL 具塞圆底试管，减少了转移过程中的损失，平行性更好；溶剂抽提3 次，脂肪基本上能够抽提完全。值得注意的是，通过几种抽提溶剂比对发现，选用标准GB 5009.6—2016 中所用抽提溶剂（即乙醚），其抽提效果最好。通过对大豆粉质控样检测对比，优化后的检测方法Z 值为1.47，结果满意，此时脂肪含量测定值更接近指定值。

酸水解法测定大豆脂肪含量优化后的检测方法，脂肪提取效果更彻底，损耗低，平行性、精密度优于原方法；对今后实验室进行酸水解法测定大豆粉中脂肪含量提供了可靠的试验数据，具有一定的指导作用。