干制扇贝柱多糖热水辅助酶解法提取工艺优化

2022-06-17李智博

农产品加工 2022年9期

薛蕊，孙莉，李智博

（1.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023；2.大连理工大学附属学校圣克拉校区，辽宁大连 116023）

0 引言

海湾扇贝（Argopecten irradians）是一种重要的经济海洋贝类，属于软体动物门，扇贝科。作为一种具有滋阴补肾功效的营养保健品而深受消费者青睐[1]。据报道，扇贝富含蛋白质、多糖和矿物质[2-6]。近年来，有关研究证实贝类多糖在抗肿瘤、保肝、抗病毒和抑菌等方面均有一定效果[7-10]，因而成为重要的功能食品资源[11]。

水产品中蛋白质含量较高，蛋白质和多糖在干燥过程中会发生物理化学反应，对于多糖功能活性的影响比较大[12]。扇贝具有季节性强、不易贮藏的特性。因此，干制成为扇贝食用和贮藏的主要手段。现阶段扇贝干燥的研究主要集中在干燥效率、产品外观和复水率等方面[13-15]，且多糖的提取工艺多集中于植物或中药材[16-17]，对于干制水产品多糖的提取工艺报道比较少。

结合单因素试验和正交试验，优化热水辅助酶解法提取干制扇贝柱多糖的工艺，为干制扇贝的营养与加工开发提供理论和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜海湾扇贝柱，大连玉洋集团有限公司提供；木瓜蛋白酶（10 万U/g）、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚、95%乙醇，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

固形物计，日本ATAGO 公司产品；DS-1 型高速组织捣碎机，上海标本模型厂产品；SB-120D 型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；RE-5203 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器产品；SHZ-D 型循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司产品；PHS-3C 型精密pH 计，上海雷磁仪器厂产品；HH-6 型数显恒温水浴锅，国华电气有限公司产品；GI21M 型湘仪离心机，上海医疗器械有限公司手术器械厂产品；FD-1 型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品；SYNERGY HI 酶标仪，美国伯腾仪器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱，上海龙跃仪器设备有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 干贝柱的制备

取新鲜扇贝柱于2 倍质量的水中，待水沸腾后加入6%（V/W）鲜贝柱质量的盐于锅中蒸煮6 min，捞出沥水后将煮制扇贝于60 ℃烘箱中干燥40 min，取出后晾晒至水分活度15%～20%。

1.3.2 干贝柱多糖的提取工艺流程

新鲜贝柱→烘干→破壁→热水浸提处理→离心、浓缩→乙醇沉淀→挥醇→木瓜蛋白酶酶解处理→离心、醇沉→挥醇→扇贝粗多糖提取液→冻干→测定。

1.3.3 干贝柱多糖热水浸提条件的优化

热水浸提正交试验因素与水平设计见表1。

表1 热水浸提正交试验因素与水平设计

由表1 可知，设计三因素三水平的正交试验优化热水法提取干贝柱多糖的工艺，选用不同料液比、浸提时间和浸提温度的条件，获得的浸提液加入3倍体积95%乙醇，于4 ℃下醇沉过夜，收集沉淀，挥醇后冷冻干燥，测定多糖纯度。

1.3.4 木瓜蛋白酶酶解条件的优化

超声醇沉后的溶液调整固形物为10%，采用木瓜蛋白酶进行酶解[18]。优化因素为酶解时间（1，2，3，4，5 h），酶解温度（40，45，50，55，60 ℃），加酶量（1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%），酶解pH 值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）。固定条件为酶解时间3 h，酶解温度50 ℃，pH 值7.0，加酶量2%。醇沉后冷冻干燥，测定多糖纯度。在单因素试验基础上确定酶解时间为3 h 进行响应面试验[19]，进一步优化酶解工艺。选择响应面试验中的最适项并综合，按上述方法二次醇沉，收集沉淀，冷冻干燥后即得干贝柱粗多糖。

酶解提取多糖的响应面试验因素与水平设计见表2。

表2 酶解提取多糖的响应面试验因素与水平设计

1.3.5 干贝柱多糖纯度的测定

用苯酚-硫酸法[20]测定干燥贝柱多糖含量，选择葡萄糖作为标准品，测定3 组平行取平均值。纯度的计算公式为：

式中：m0——样品溶液中葡萄糖含量，mg；

n——样品溶液稀释倍数；

m——干燥的扇贝多糖的质量，mg。

1.4 数据处理

试验结果以平均值±标准偏差表示，试验数据采用用SPSS Statistics 17.0 软件进行单因素ANOVA分析，显著性水平设定为0.05。

2 结果与分析

2.1 热水浸提正交试验结果

热水浸提正交试验设计与结果见表3，热水浸提正交试验结果与方差分析见表4。

表3 热水浸提正交试验设计与结果

表4 热水浸提正交试验结果与方差分析

由表3 与表4 可知，热水浸提3 个因素中浸提时间影响最为显著，各因素对多糖纯度的影响程度顺序依次为浸提时间（B）＞浸提温度（A）＞料液比（C）。最优工艺为A2B2C3，即浸提温度80 ℃，浸提时间4 h，料液比1∶40（g∶mL）。3 次平行试验浸提液多糖纯度为26.92%±0.94%。

2.2 木瓜蛋白酶酶解条件单因素优化结果

木瓜蛋白酶酶解条件对干贝柱多糖纯度的影响（n=3）见图1。

图1 木瓜蛋白酶酶解条件对干贝柱多糖纯度的影响（n=3）

由图1 可知，随着酶解时间、酶解温度、加酶量、pH 值的增加，干贝柱多糖纯度均呈先上升后下降的趋势。酶解时间3 h，温度温度55 ℃，加酶量2%，pH 值7.0 表现出最佳酶解效果，多糖纯度分别为44.5%±0.74%，46.71%±0.66%，44.72%±0.87%，43.56%±0.65%。

2.3 木瓜蛋白酶酶解条件响应面优化结果

2.3.1 响应面试验结果与方差分析

以干贝柱多糖提取物的多糖纯度为试验指标，采用统计分析软件Design Expert 8.0，根据Box-behnken中心组合设计原理，设计三因素三水平的响应面分析试验。

试验设计及结果见表5，回归模型的方差分析见表6。

表5 试验设计及结果

由表6 可知，该试验模型F 值很高而p 值极低（p＜0.000 1），失拟项不显著，该模型R2为0.997 3，说明模型高度显著并可以用于分析预测酶解工艺条件。另外，由表6 可知，A'、B'、A'2、B'2、C'2对多糖纯度影响极显著（p＜0.000 1），C'对多糖纯度影响显著（p＜0.05）；其他因素的影响不显著。干贝柱多糖提取物的多糖纯度（Y），酶解温度（A'）、pH值（B'）、加酶量（C'）的二次多项回归方程为：

表6 回归模型的方差分析

2.3.2 交互作用分析

各因素交互作用的响应面与等高线图见图2。

通过图2 可以预测、检验变量的响应值，同时可以确定变量之间的相互关系，响应面越陡峭，等高线呈椭圆形表示交互作用越显著[21]。

由图2 可知，酶解温度（A'）、pH 值（B'）、加酶量（C'）对多糖纯度的影响均很明显，而pH 值与加酶量的交互作用（B'C'）要明显于pH 值与酶解温度（A'B'）、温度与加酶量（A'C'）的交互作用，符合方差分析结果。

图2 各因素交互作用的响应面与等高线图

2.3.3 试验结果验证

通过Design Expert 8.0 软件分析，得到酶解提取干贝柱多糖的最佳条件为酶解温度57.8 ℃，酶解pH值7.07，加酶量1.98%，提取物的多糖纯度达到48.80%。根据实际情况修正最佳条件为酶解温度57.8 ℃，酶解pH 值7.1，加酶量2%。根据修正条件进行3 组验证试验，得多糖纯度为48.62%±0.79%，与理论预测值较接近，证明结果可信度高。